CRISPRcas9基因敲除原理及其应用.pdfVIP

CRISPR/Cas9 基因敲除原理及其应用 CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解 入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机 。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成 3类，其中 Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统 [1 只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件 。 目前，来自Streptococcuspyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白 （含 有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合 成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的 DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。 由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点，因 此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物 [1 细胞，是目前最高效的基因组编辑系统 。 通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guideRNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便 研究者使用。通过将表达sgRNA 的原件与表达Cas9 的原件相连接，得到可以同时表达两者 [2,3 的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作 。 目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下： Cas9质粒构建 设计2条单链oligo序列； 退火形成双链DNA pGK1.1 将双链DNA 连接到载体 中 转化 G10 competent cell 筛选阳性克隆；测序验证 序列；质粒大提；电转染 靶细胞 在细胞内 crRNA 识别靶 位点，Cas9对靶位点进行 随机剪切 TM Cruiser 酶切细胞池，计 TM 算突变率；Cruiser 酶切 初筛阳性克隆；将阳性克 隆测序验证；做敲除序列 比对分析。 目前常见的CAS9普通质粒有 （汉恒生物提供cas9质粒试剂盒）： 虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性 等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用 质粒见addgene （lentiCRISPRv2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast ），慢病毒可以整合入 宿主基因组中，长期稳定的表达 （汉恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包装），但是由于慢病 毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大（大于4kb），且长期插入可能导致乱切，脱靶 等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获 得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲 除效果。（汉恒生物提供CRISPR/cas9 腺病毒包装）