NtSKP1基因的RNAi载体构建及对烟草的转化.pdfVIP

每 北 患业 学报 2010，19(8)：95100 ActaAgriculturaeBoreali—occidentalisSinica NtSKP1基因的RNAi载体构建及对烟草的转化 张付云 ，李 妍 ，李云冰 ，张 瑛 ，赵小明 ，杜昱光 (1．大连水产学 院，辽宁大连 116023；2．中国科学院大连化学物理研究所 ，辽宁省碳水化合物研究重点实验室 ，辽宁大连 116023) 摘 要 ：根据枯斑三生烟~ASKP1基因(NtSKP1)的序列 ，设计二对分别含有特定酶切位点的特异引物 ，以重 组质粒 pMD18一SKP1为模板 ，分别扩增 目的基因的正反 向片段 (约 473bp)。将反 向 目的片段插人 中间载体 pHANNIBAL内含子右侧 ，正向 目的片段插入该载体 内含子左侧 ，再经 NotI酶切 回收约 3916bp 目的片 段 ，插入到双元载体质粒 pART27中，成功构建 了含NtSKP1基 因片段正反 向重复序列 的植物表达载体 pART27一skplsa。将 pART27一skplsa质粒导人根癌农杆菌 LBA4404中并转化烟草叶片细胞 ，经选择分化 培养 ，获得转基因烟草 。 关键词 ：NtSKP1基 因；RNA干扰 ；载体构建 ；转基 因烟草 中图分类号 ：$573 文献标识码 ：A 文章编号 ：1004—1389(2010)08—0095—06 ConstructionofRNAiExpressionVectorofNtSKP1 andTransformation in Tobacco ZHANG Fuyun ，LIYah ，LIYunbing ，ZHANG Ying ． ZHAO Xiaoming andDU Yuguang (1．DalianFisheriesUniversity，DalianLiaoning 116023，China；2．DalianInstituteofChemicalPhysics．Chinese AcademyofSciences，LiaoningProvincialKeyLaboratoryofCarbohydrate，DalianLiaoning 116023．China) Abstract：Accordingto thesequenceofSKPifrom Nicotianatabacum var．SamsunNN (NtSKP1 ， twopairsofspecificprimerscontaining specia1restrictionenzymesitesweredesigned ． Thetargetre— verseandforwardfragments (473bp)，wereamplifiedandinsertedintorightandleftsideofintronin intermediatedvectorpHANNIBAL respectively．Then thetargetfragmentabout3916bpwascutby NotI from recombinantintermediatedvector，andclonedintobinaryplasmidpART27．Plantexpres— sion plasmidpART27一skplsa，with invertedrepeatDNA fragmentofNtSKP1 ，wassuccessfullycon— structed，andpART27一skplsawasintroducedintoAgrobacteriumtumefaciensLBA4404．Thentrans— formedtobaccoleaves，andthetransgenicplantsoftobaccowereobtained． Keywords：GeneofNtSKP1 ；RNA interfering；VectorConstruction；Transgenictobacco S期激酶相关蛋 白 1(S—PHASEKIN