siRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HepG2.2.15细胞实验研究.pdfVIP

  siRNA 表达载体与阳离子脂质体复合物转染  HepG2.2.15细胞实验研究* 杨慧 刘明社 张国英 张芸 赵中夫 山西长治医学院肝病研究所（046000）  E­mail：zhaozf_1226@163.com  摘 要： 目的 观察针对 HBV X 的 siRNA 表达载体 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体的 复合物对 HepG2.2.15 细胞转染效果及其对 HBVM 表达的影响。 方法 以 pGenesil-siAFP 表 达载体 和非转染细胞分别作 非特异性序 列对 照组和 空白对 照组 ，用不 同配比浓度 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体的复合物转染 HepG2.2.15 细胞，荧光显微镜下观察并计算 转染阳性细胞百分率，筛选出最佳转染效率的剂量配比。于转染后 24、48、72 小时采用时 间分辨荧光免疫测定技术 （TRFIA）检测上清液中 HBsAg 和 HbeAg。结果 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体复合物 8μl：2.5μg 剂量配比组的平均转染率达到了 55.1±4.3％，且不 影响细胞活性； 转染后 48 小时和 72 小时后该 siRNA 表达载体对 HepG2.2.15 细胞表达 HBsAg 和 HbeAg 抑制作用显著（P＜0.05）；结论 8μl：2.5μg 剂量配比组的 pGenesil-HBV X 与 阳离子脂质体复合物是最佳的转染剂量配比，能有效抑制 HepG2.2.15 细胞表达 HBsAg 和 HbeAg。 关键词：siRNA，转染，阳离子脂质体，HepG2.2.15 细胞  1.  引 言 RNA 干扰技术，是由 21～23nt 组成的双链 RNA 介导的、序列特异性诱发同源基因转录 后沉默（post-transcriptional gene silence , PTGS）的技术。这一技术为抗病毒治疗提 [1-3] 供了新策略 。 在已报道应用 RNAi 抑制乙肝病毒的实验中大多采用体外转录合成 siRNA 或构建 siRNA [4,5] 表达载体与病毒基因表达载体共同转染目的细胞的方法 。这些研究注重对转染阳性细胞 靶基因的抑制效果，较少考虑转染阳性率。为使 RNAi 抗病毒治疗试验研究能为它的实际应 用提供更有用的证据，我们采用了与共转染不同的试验条件，选用可以持续分泌 HBV 各种病 毒标志物及 HBV-DNA 的 HepG2.2.15 细胞为实验对象，仅转染 siRNA 表达载体，对培养于同 一体系中的转染细胞与未转染细胞上清液 HBVM 进行检测。探讨不同配比浓度 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体 Metafectene 的复合物转染 HepG2.2.15 细胞的转染效率和 RNAi 的抗 HBV 作用。 *本课题得到山西省自然基金（项目编号资助。 ­ 1 ­    2. 材料与方法  2.1 主要试剂：高糖型 DMEM 培养基购自美国 GIBCO 公司，新生牛血清购自杭州四季 青生物制品公司，Metafectene 转染试剂购自德国 BIONTEX， HBsAg、HBeAg 荧光免疫分析 试剂盒购自苏州新波生物技术有限公司。  2.2 HepG2.2.15细胞的培养及准备：HepG2.2.15 细胞由北京大学医学部病毒研究 室惠赠，本室传代与培养。HepG2.2.15 细胞生长于高糖型 DMEM 中（含 10％新生牛血清、 2mmol/l 谷氨酰胺、100U/ml 青霉素及 100μg/ml 链霉素），并在 37℃、5％CO 孵箱中进行