rAAV1EGFP和rAAV2EGFP转染犬骨髓间充质干细胞的比较.docVIP

ｒＡＡＶ１-ＥＧＦＰ和ｒＡＡＶ２-ＥＧＦＰ转染犬骨髓间充质干细胞的比较 　　作者：刘斌，蔡道章，戎利民，王昆，曾春，谢沛根 作者单位：中山大学附属第三医院骨科， 广东 广州 510630 　　【摘要】 研究不同血清型腺相关病毒(rAAV)载体介导的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)对体外培养犬骨髓间充质干细胞(MSC)的转染效率及其毒性作用。【方法】 应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养犬MSC，倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态，透射电镜观察其超微结构，流式细胞仪鉴定其表面标记物。取第3代MSC，以MOI为104 ～ 105 v.g./cell 的rAAV1-EGFP 和rAAV2-EGFP进行转染，3、7、21 d后荧光显微镜观察检测转染效率;MTT法检测rAAV1-EGFP 和rAAV2-EGFP对MSC的毒性作用。 【结果】 原代及传代培养的MSC呈梭形外观，具有较强的增殖能力。MSC超微结构显示其胞体较小，细胞核/浆比例大，胞浆少，染色质较疏松。细胞表面抗原CD29、CD44表达阳性，CD34表达阴性。随MOI的增加及时间的延长，rAAV1-EGFP、rAAV2-EGFP对犬MSC的转染效率逐渐增加，rAAV2-EGFP转染效率明显高于rAAV1-EGFP(P 0.01)。转染MSC细胞后，细胞生长正常，MTT法显示各转染组与未转染组的光密度值无统计学差异(P 0.05)。 【结论】 相对犬MSC，rAAV2是一种比rAAV1更优越的转基因载体，而且对细胞生长无明显抑制，作为组织工程种子细胞的载体是安全可行的。 　　【关键词】 骨髓间充质干细胞; 腺相关病毒; 增强绿色荧光蛋白; 组织工程; 犬 　　Comparison of Transfection Effect between rAAV1-EGFP and rAAV2-EGFPinto Canine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells　LIU Bin， CAI Dao-zhang*， RONG Li-min， WANG Kun， ZENG Chun， XIE Pei-gen　Department of Orthopaedics， The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China　Abstract： 【Objective】 To investigate the influence of enhanced green fluorescent protein gene mediated by recombinant adeno-associated virus vector with different serotypes on the transfection efficiency and cytotoxicity to canine bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. 【Methods】 The MSC from canine bone marrow were isolated and cultured in vitro by density gradient centrifugation and adherence screening method. The morphology of MSC was observed by inverted phase contrast microscope and Giemsa stain. The ultrastructure of MSC was observed by transmission electron microscope. The flow cytometry was used to detect surface antigens of MSC. The third passage of MSC were transfected with rAAV1-EGFP and rAAV2-EGFP at the MOI of 104 ～ 105 v.g./cell. After 3， 7， and 21 days， the transfection efficiency was detected by the fluorescence microscope. MTT was performed to detect the cytotoxicity of rAAV1-EGFP and rAAV2-EGFP on MSC. 【Results】 The MSC appeared morph