硼肥和芸苔素内酯对油茶生理生化指标及产量的影响试验方案.docVIP

硼肥和芸苔素内酯对油茶开花生理生化指标 及产量的影响试验方案 1.1供试材料 试验地点设在永丰……,并对试验点土壤进行基础养分状况分析（pH、有机质、全N、全P、全K、速效N、速效P、速效K、交换性Ca、交换性Mg、交换性B含量）。 供试肥料：硼肥为硼砂（含B2O3 11.3%左右），BRs选用由上海威敌生化(南昌)有限公司生产的0.01%芸苔素内酯乳油“园丰素”。 供试油茶品种为？，树龄 1..2 试验方法 1.2.1试验设计 试验分6个处理：（1）喷施0.2%的硼砂溶液；（2）喷施BRs 0.01 mg/kg（每1ml BRs 乳油加水10kg） ；（3）喷施BRs 0.05 mg/kg（每5ml BRs 乳油加水10kg）;（4）喷施BRs 0.1 mg/kg（每10ml BRs 乳油加水10kg）；（5）喷施BRs 0.15 mg/kg（每15ml BRs 乳油加水10kg）；（6）喷施硼砂0.2% + BRs0.1mg/kg；（7）喷施清水做对照。每个处理3个重复，每小区5株，共90株。试验期间各处理除喷药不同外，其余管理措施均一致。喷施时间分别在盛花期和座果期各喷1次。 1.2.2 取样方法 依次于喷药后的第1d，5d，10d，15d，20d，25 d，30d 取新梢倒数第2片展开叶，共取样7次，对叶片进行各种激素含量、酶活性及可溶性蛋白质含量和可溶性糖含量的测定。 1.2.3 生理指标的测定方法 1.2.3.1叶片内源激素的测定 ①提取液：80％甲醇，内含1m mol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解BHT，在配成80％的浓度)。 ②称取0.5g植物样品，加2ml样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10ml离心管，在用2ml提取液分次将研钵洗干净，一并转入离心管中，摇匀后放置在4℃冰箱中。 ③ 4℃下提取4小时，1000g离心15min(约4000rpm)，取上清液。沉淀中加1ml提取液，搅匀，置在4℃冰箱中再提取1h，离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。 采用酶联免疫分析方法(ELISA)，每处理作三次重复，用SPASS软件对试验数据进行分析。 1.2.3.2 叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 参照张宪政的方法，取新鲜叶片0.2g，用pH7.8的磷酸缓冲液提取，冰浴研磨，10000 g离心20 min，上清液为待测液。用50 mM pH7.8磷酸缓冲液、13mM蛋氨酸、175mM氮蓝四唑(NBT)和0.1mM EDTA按4:1:2:1配制成反应体系溶液，在4ml反应体系溶液中先加200μL酶液，再加50μL核黄素(50 mM)，立即置于4000 Lux荧光灯下进行光还原反应，15 min后用黑布遮光终止反应。与此同时，进行另外一组类似的平行处理(不加酶液)，作为空白对照，并以pH7.8磷酸缓冲液调零，紫外分光光度计在560nm波长下测定OD值。计算公式如下： SOD OD/g·FW=(ACK-AE)×V/(FW×Vt) ACK=对照吸光值 AE=样品吸光值 V=酶液总体积(ml) FW=芽鲜重(g) Vt=取用的酶液体积(ml) 1.2.3.3 叶片过氧化物酶(POD)活性测定 取上述测定SOD活性的酶提取液20μl，加入预冷的pH7.0磷酸缓冲液2.91 ml，20mmol/l愈创木酚50μl，40mmol/L H2O2 20μl，充分混匀后在30℃恒温水浴中保温3min，用20%三氯乙酸20μl终止反应。用紫外分光光度计测定470nm下吸光度，计算POD活性。计算公式如下： POD OD/g·FW=AE×V/(FW×Vt) AE=样品吸光值 V=酶液总体积(ml) FW=芽鲜重(g) Vt=取用的酶液体积(ml) 1.2.3.4 叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定 根据王敬文等(1981)的方法，称取新鲜叶片0.2 g，加5 mL预冷的硼酸缓冲液(0.l0 mol/L pH8.8；含5 mmol/L巯基乙醇，0.50 g PVP)，冰浴中研磨匀浆，转入离心管中于4℃，10000 rpm冷冻离心30 min，取上清液测定PAL活性。 PAL活性测定方法为：吸取l mL 0.02 mo1/L的L-苯丙氨酸和2 mL 0.10 mol/L硼酸缓冲液(pH 8.8，对照液中不加底物，直接加3 mL硼酸缓冲液)混匀，置40℃水浴中保温3 min后，立即加入0.2 mL酶液，摇匀，恒温下反应30 min，在冰浴中终止反应，用756型紫外可见分光光度计测定波长290 nm处的OD值，以每毫升酶液每小时光密度值增加0.0112为一个酶活性单位(U)，计算出PAL活性大小。 1.2.3.5 叶片可溶性糖含量测定 采用蒽酮比色法测定葡萄糖(蔗糖)标准溶液配制：称取