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硼肥和芸苔素内酯对油茶生理生化指标及产量的影响试验方案.doc
硼肥和芸苔素内酯对油茶开花生理生化指标
及产量的影响试验方案
1.1供试材料
试验地点设在永丰……,并对试验点土壤进行基础养分状况分析(pH、有机质、全N、全P、全K、速效N、速效P、速效K、交换性Ca、交换性Mg、交换性B含量)。
供试肥料:硼肥为硼砂(含B2O3 11.3%左右),BRs选用由上海威敌生化(南昌)有限公司生产的0.01%芸苔素内酯乳油“园丰素”。
供试油茶品种为?,树龄
1..2 试验方法
1.2.1试验设计 试验分6个处理:(1)喷施0.2%的硼砂溶液;(2)喷施BRs 0.01 mg/kg(每1ml BRs 乳油加水10kg) ;(3)喷施BRs 0.05 mg/kg(每5ml BRs 乳油加水10kg);(4)喷施BRs 0.1 mg/kg(每10ml BRs 乳油加水10kg);(5)喷施BRs 0.15 mg/kg(每15ml BRs 乳油加水10kg);(6)喷施硼砂0.2% + BRs0.1mg/kg;(7)喷施清水做对照。每个处理3个重复,每小区5株,共90株。试验期间各处理除喷药不同外,其余管理措施均一致。喷施时间分别在盛花期和座果期各喷1次。
1.2.2 取样方法
依次于喷药后的第1d,5d,10d,15d,20d,25 d,30d 取新梢倒数第2片展开叶,共取样7次,对叶片进行各种激素含量、酶活性及可溶性蛋白质含量和可溶性糖含量的测定。
1.2.3 生理指标的测定方法
1.2.3.1叶片内源激素的测定
①提取液:80%甲醇,内含1m mol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚,为抗氧化剂,先用甲醇溶解BHT,在配成80%的浓度)。
②称取0.5g植物样品,加2ml样品提取液,在冰浴下研磨成匀浆,转入10ml离心管,在用2ml提取液分次将研钵洗干净,一并转入离心管中,摇匀后放置在4℃冰箱中。
③ 4℃下提取4小时,1000g离心15min(约4000rpm),取上清液。沉淀中加1ml提取液,搅匀,置在4℃冰箱中再提取1h,离心,合并上清液并记录体积,残渣弃去。
采用酶联免疫分析方法(ELISA),每处理作三次重复,用SPASS软件对试验数据进行分析。
1.2.3.2 叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
参照张宪政的方法,取新鲜叶片0.2g,用pH7.8的磷酸缓冲液提取,冰浴研磨,10000 g离心20 min,上清液为待测液。用50 mM pH7.8磷酸缓冲液、13mM蛋氨酸、175mM氮蓝四唑(NBT)和0.1mM EDTA按4:1:2:1配制成反应体系溶液,在4ml反应体系溶液中先加200μL酶液,再加50μL核黄素(50 mM),立即置于4000 Lux荧光灯下进行光还原反应,15 min后用黑布遮光终止反应。与此同时,进行另外一组类似的平行处理(不加酶液),作为空白对照,并以pH7.8磷酸缓冲液调零,紫外分光光度计在560nm波长下测定OD值。计算公式如下:
SOD OD/g·FW=(ACK-AE)×V/(FW×Vt)
ACK=对照吸光值
AE=样品吸光值
V=酶液总体积(ml)
FW=芽鲜重(g)
Vt=取用的酶液体积(ml)
1.2.3.3 叶片过氧化物酶(POD)活性测定
取上述测定SOD活性的酶提取液20μl,加入预冷的pH7.0磷酸缓冲液2.91 ml,20mmol/l愈创木酚50μl,40mmol/L H2O2 20μl,充分混匀后在30℃恒温水浴中保温3min,用20%三氯乙酸20μl终止反应。用紫外分光光度计测定470nm下吸光度,计算POD活性。计算公式如下:
POD OD/g·FW=AE×V/(FW×Vt)
AE=样品吸光值
V=酶液总体积(ml)
FW=芽鲜重(g)
Vt=取用的酶液体积(ml)
1.2.3.4 叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定
根据王敬文等(1981)的方法,称取新鲜叶片0.2 g,加5 mL预冷的硼酸缓冲液(0.l0 mol/L pH8.8;含5 mmol/L巯基乙醇,0.50 g PVP),冰浴中研磨匀浆,转入离心管中于4℃,10000 rpm冷冻离心30 min,取上清液测定PAL活性。
PAL活性测定方法为:吸取l mL 0.02 mo1/L的L-苯丙氨酸和2 mL 0.10 mol/L硼酸缓冲液(pH 8.8,对照液中不加底物,直接加3 mL硼酸缓冲液)混匀,置40℃水浴中保温3 min后,立即加入0.2 mL酶液,摇匀,恒温下反应30 min,在冰浴中终止反应,用756型紫外可见分光光度计测定波长290 nm处的OD值,以每毫升酶液每小时光密度值增加0.0112为一个酶活性单位(U),计算出PAL活性大小。
1.2.3.5 叶片可溶性糖含量测定
采用蒽酮比色法测定葡萄糖(蔗糖)标准溶液配制:称取
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