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体外培养大鼠软骨细胞老化的机制初探 　　作者：陈晓东 林建华 作者单位：深圳平乐骨伤科医院，福建医科大学附属第一医院骨科 广东 深圳 518010 　　【摘要】 目的 对体外传代培养的大鼠软骨细胞进行相关因子检测，初步探讨其复制性老化(传代培养出现的老化表现)的机制。方法 对连续培养的第二、三、四代软骨细胞进行实验，采用免疫细胞化学检测p16 、pRb、 E2F、 CyclinD 、CDK4等因子表达水平，TRAP-ELISA检测端粒酶活性，观察软骨细胞老化过程中各因子的变化。结果 随着细胞复制性老化p16、pRb、CyclinD表达水平显著上升(P0.01)，E2F、CDK4、端粒酶表达水平显著下降(P0.01)。 结论 体外培养软骨细胞老化过程与p16、pRb、CyclinD表达增加，E2F、CDK4、端粒酶表达下降密切相关。 　　【关键词】 软骨细胞;老化;机制 　　基金项目：福建省科技计划重大资助项目(2004Y018) 　　Preliminary probe into aging mechanism of chondrocyte in the rats in vitro 　　CHEN Xiao-Dong, LIN Jian-Hua. 　　Pingle Bone Injuries Hospital in Shenzhen, Shenzhen 518010, Guangdong, China 　　【Abstract】 Objective To determine the correlated factors of chondrocyte in the rats in vitro to explore its replicative senescence mechanism. Methods The expression levels of p16, pRb, E2F, CyclinD and CDK4 were determined by immunocytochemistry and telomerase activity were detected by TRAP-ELISA in the second, third and fourth generation chondrocytes of consecutive cultivation to observe their changes in senescence process. Results The expression levels of p16, pRb, CyclinD significantly increased (P0.01), those of E2F, CDK4 and telomerase obviously decreased (P0.01) with replicative senescence in chondrocytes.Conclusions The senescence process of chondrocyte in the rats in vitro is closely related to the increased expressions of p16, pRb and CyclinD and the decreased expressions of E2F, CDK4 and telomerase. 　　【Key words】 Chondrocyte; Senescence; Mechanism 　　正常人类细胞在体外组织培养的传代过程中，逐渐丧失增殖传代的能力，最终达到一种不可逆的增殖停滞状态，这一现象是由Hayflick〔1〕等在研究人类二倍体成纤维细胞时最早报道的。这种似乎是无限期的增殖停滞状态被命名老化(senescence)，由于老化是由分裂传代而达到的，故将这一过程命名为复制老化(replicative senescence)。软骨细胞属于终末分化细胞，其在体外的传代培养过程中出现增殖停滞，表型丧失，呈老化状态，这种老化属于复制性老化。细胞老化是细胞周期调控下多基因参与的复杂生理病理过程，具有一定的可控性。细胞周期调控因子及老化相关调控因子p16、pRb、CDK、cyclin、E2F、端粒酶等相互作用导致细胞老化。基于本研究的前期实验发现大鼠软骨细胞复制性老化发生在第4代〔2〕，这一发现与Loeser等〔3〕的研究结果一致，本实验将从细胞老化调控因子方面对体外培养的大鼠软骨细胞进行老化机制的初步探讨。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要材料 　　清洁级SD大鼠8只(福建医科大学实验动物中心提供，闽验证字2