免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法永诺生物.pdfVIP

免疫沉淀（Immunoprecipitation ）实验操作方法 实验原理： 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP ）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如 protein A/G 特异性地结合到免疫球蛋白（抗体）FC 片段的现象而开发出来的特异分离富集 抗原的方法。目前多用预先结合固化在Agarose beads 上的protein A/G （Agrose-proteinA/G ）， 使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G 、抗体、抗原复合 物，利用Agarose beads 的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原。 实验步骤： 6 1. 处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好细胞模型。一般3 ×10 细胞/处理(即六孔 板一个孔，约200ug总蛋白) 。 2. 配IP 裂解液：200ul/孔（6 孔板），并加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实 验结果则应加入磷酸酶抑制剂。注意抑制剂的要现加现用。 3. 收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1×PBS （4 度）洗 1 遍，每孔加入200ul IP 裂解 液，冰上静置5 分钟后刮下细胞并收集至EP 管中。 4. 超声：强度37 ％，5 秒×4 次（程序07 ）。目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA, 但可能会影响蛋白质之间的相互作用，进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。 5. 离心细胞裂解液：4 度10000rpm 10 分钟。 6. Agrose-proteinA/G 清洗：一般1ug 抗体对应15ul Agrose-proteinA/G （不同公司产品可能 不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G 用量 与结合抗体的用量一致。取相应量的Agrose-proteinA/G 到EP 管中（剪枪头）并用500ul1 ×PBS （4 度）洗两遍，5000rpm × 2 分钟，吸掉上清备用。 7. 细胞裂解液预清洗：为去除非特异作用，细胞裂解液先用 Agrose-proteinA/G 预清洗。 转移步骤5 离心好的细胞裂解液上清至步骤6 洗好的Agrose-proteinA/G 中，4 度翻转1 小时。 8. 抗体和Agrose-proteinA/G 预孵育：为减少游离抗体消耗抗原造成IP 效率下降，将抗体 和Agrose-proteinA/G 进行预孵育。在步骤6 洗好的Agrose-proteinA/G 中加入200ul 含 0.1%BSA 的IP 裂解液及相应量的抗体，4 度翻转 1 小时。不同抗体时间可能有不同。 9. 抗原抗体孵育：步骤7 和8 后进行离心（5000rpm 2 分钟），将预清洗好的细胞裂解液 转移到含预孵育好的抗体和Agrose-proteinA/G 的EP 管中，4 度孵育过夜。 10. 洗IP 复合物：步骤9 后离心（5000rpm 2 分钟），吸掉上清，加入IP 裂解液（一般不用 加抑制剂）500 ul，弹匀后4 度摇转5 分钟，重复6 次。最后一次离心后加入3 ×SDS 60ul。 11. WB 检测。 附注： IP lysis buffer Tris 50 m M PH 7.4 NaCl: 150m M EGTA 2m M EDTA 1 m M Triton X-100 1% 磷酸酶抑制剂：Pyrophosphate 2.5m M Glycerol phosphate 1m M Na3VO4 1m M 蛋白酶抑制剂：PMSF 1m M Leupeptin 1ug/ml Aprotinin 5ug/ml IP lysis buffer Reagent