利用正交设计法优化观赏贝母ISSR-PCR反应体系.pdfVIP

江苏农业科学 2011年第 1期 一 33一 吴晓清，周玉珍，娄晓鸣，等．利用正交设计法优化观赏贝母 ISSR—PCR反应体系[J]．江苏农业科学，2011(1)：33—36 利用正交设计法优化观赏贝母 ISSR—PCR反应体系 吴晓清 一，周玉珍 ，娄晓呜’，张文婧 ，成海钟 (1．苏州农业职业技术学院，江苏苏州 215008；2．南京林业大学，江苏南京 210037) 摘要：利用正交试验设计的方法，对观赏贝母 ISSR—PCR反应体系的5因素 (模板 DNA、引物、Mg“、dNTP、Taq DNA聚合酶的浓度)在4水平上进行优化试验，PCR结果用 Mnitab数据处理软件分析，建立的最佳反应体系(20 ) 为：模板 DNA10ng、引物0．5p~mol／L、Mg 2．5mmol／L、dNTP0．20mmol／L、TaqDNA聚合酶2．0U。对观赏贝母 Is- SR—PCR最佳反应体系进行了梯度退火试验，得到的最佳退火温度为57．9oC。 关键词：观赏贝母；ISSR—PCR；反应体系；正交设计 中图分类号：$682．2 90．1 文献标志码 ：A 文章编号：1002—1302(2011)Ol一0033—03 贝母属(FritillariaL．)是狭义百合科中最大的一个属，是 行梯度检测分析，旨在建立适合观赏贝母 ISSR—PCR的最佳 重要的药用和观赏植物 。贝母是百合科贝母属的球根花 反应体系，为进一步分析观赏贝母的亲缘关系创造条件。 卉，我国多作为药用。近年来，欧美国家以观赏为 目的，用于 1 材料与方法 庭院种植，布置环境，也有的制作盆景 。观赏贝母 自然种 质资源丰富，植株茎秆挺拔 ，高度因种类、品种而异 ，可视 目的 1．1 材料 不同而适地、适时选用。观赏贝母叶片青翠，花姿色彩雅致多 1．1．1 试验材料 选用材料为波斯贝母 (Fritillariapersica) 彩，一次栽植，多年欣赏 ，花期 3__6月份，是早春初夏园林花 嫩叶，2009年 4月采 自于苏州农业职业技术学院园艺中心。 卉的佼佼者。其中尤以花贝母观赏价值最高，育成的品种也 1．1．2 试剂 试验所用 的Tat／酶、dNTP购 自上海鼎 国有限 最多，高秆品种适用于庭院种植，布置花境或基础种植均可， 公司；ISSR引物、MgC12、PCRBuffer、DNAmarker(DL2000)购 矮生品种则适合盆栽，观赏性极强，因此贝母属植物具有潜在 自上海生工生物工程公司。ISSR引物采用加拿大哥伦 比亚 的资源优势和广泛的利用前景。利用分子标记分析观赏贝母 大学 (UniversityofBritishColumbia，UBC)所设计的引物。经 种间亲缘关系，对其优 良品种选育和产业发展具有巨大作用。 初步筛选，把引物UBC873(GACA)作为正交试验引物。 分子标记是进行品种鉴别和亲缘关系分析的有效工具， 1．2 方 法 它是基因组 DNA变异水平的直接反映，多态性好，遗传稳定 1．2．1 DNA的提取 采用改 良CTAB法提取基因组DNA， 性离，不受环境条件的影响。ISSR(intersmiplesequencere— 用 0．8％琼脂糖凝胶电泳定性检测DNA质量，分光光度法定 peats)是 1994年 由Zietkiewiez等 创建的一种简单序列重复 量测定浓度及纯度，并将其稀释至 10ng／L备用。 区间扩增多态性分子标记，用于检测 SSR问DNA序列差异。 1．2．2 PCR正交试验设计与分析 采用L，(4)正交试验 由于 ISSR标记技术结合了RAPD标记技术和 SSR标记技术 设计，对模板DNA、引物、Mg“、dNTP和 酶量 5个因素设 的优点，试验操作简单 、快速、高效、重复性高、稳定性好、耗资 计4个水平 (表 1、表2)。PCR反应体系为20 ，除表中因 少，在不知道DNA序列的情况下即可用引物进行 PCR扩增， 素外每管中还含有 1×PCRbuf