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- ·— — 48—-—— 江苏农业科学 2011年第 1期 俞咪娜，邓 晟，王 颖，等．寄生疫霉ParA1蛋自在毕赤酵母中的表达[J]．江苏农业科学，2011(1)：48—51 寄生疫霉 ParA1蛋白在毕赤酵母中的表达 俞咪娜 ，邓 晟，王 颖，董汉松 (南京农业大学植物保护学院植物病理学系／农业部作物病虫害监测与防控重点开放实验室，江苏南京210095) 摘要：本研究构建ParA1蛋白真核表达系统，通过诱导表达、镍柱纯化等途径，获得具有高生物学活性的ParA1 蛋白。将末端含6×His—tag的parA1基因整合到酵母胞内表达质粒pPICZ—A上，获得重组表达质粒pPICZ—A：： parA1一肌 。重组表达质粒用BstXI酶切线性化后，电转化至毕赤酵母菌KM71H中，经含抗生素Zeocin的平板、MD 平板筛选和PCR分析，鉴定得到阳性克隆。甲醇诱导重组酵母菌中ParA1蛋白表达，然后用镍柱纯化表达产物。 Tricine—SDS—PAGE电泳检测发现，纯化后收集的蛋白电泳条带清晰单一，浓度约为75ms／L。生物学活性检测表明 所得的ParA1蛋白有较高生物学活性 ，在稀释6000倍后仍可以强烈诱导烟草产生过敏反应。 关键词：ParA1蛋白；毕赤酵母；蛋白表达；纯化；过敏反应 中图分类号：$435．72 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2011)O1—0048—03 激发素 (elicitin)是一类分子量为 l0ku的胞外蛋白激发 有多种蛋白利用该系统得到了高效表达，如破伤风毒素片段 子，由卵菌纲(Oomycetes)疫霉属 (Phytophthora)和部分腐霉 C，其表达量达 l2g／L，而明胶表达量甚至达到14．8g／L 。 属(Pythium)真菌分泌，分子结构高度保守…。这类蛋白可以 对于elicitin，O’Donohue等通过毕赤酵母表达系统成功诱导 诱导茄科、十字花科的多种植物，尤其是不同种烟草 ，产生 表达其成员蛋 白Cryptogein，并得到该蛋 白的晶体结构 。 一 系列抗病防卫反应，如氧爆发(ROSburst)、水杨酸(salicyl— 为得到具有高生物学活性的ParA1蛋 白，本试验选用毕 icacid)积累、病程相关蛋 白(pathogenesis—relatedproteins)表 赤酵母表达系统异源表达该蛋 白。通过表达质粒构建、转化 达、过敏反应 (hypersensitiveresponse，HR)和系统获得抗性 和筛选 ，获得了高表达重组酵母菌；对诱导表达的蛋白进行镍 (systemicacquiredresistance，SAR)产生 。因此 elicitin在 柱纯化，得到了高活性 、电泳条带单一的ParA1蛋 白，为后续 植物防卫反应过程中具有重要作用，是解析植物与病原疫霉 解析该蛋白与植物互作提供了优 良的初始材料。 互作机制的重要工具。从发现至今，elicitin一直被作为植物 1 材料和方法 一 病原微生物互作研究中的基础材料，外源表达的elicitin更 是研究植物抗病机制的理想材料，其部分成员如Cryptogein、 1．1 材料 INF和ParA1，已被广泛系统地应用于植物一病原微生物互作 真核表达所用的酵母菌株、真核表达质粒和大肠杆菌菌 研究。 株 TOPIOF均源 于酵母表达试剂盒 EasySelectMT PichiaEx- ParA1是 由寄生疫霉 (Phytophthoraparasitica)分泌 的 pressionKit(产品批号K1740—0l，Invitrogen)，大肠杆菌菌株 elicitin。前体含有由20个氨基酸组成的信号肽，成熟蛋白由 DH5u由笔者所在实验室繁殖并保存于一80℃。 98个氨基酸组成，含有 3对二硫键 。笔者所在实验室选 蛋白纯化试剂盒 HisTrapMTHPKit(产 品批号 17—5249— 用由山东农业大学梁元存博士从Phytophthoraparasiticavar． 01，Amersham Biosciences)，质 粒