荧光真核表达载体pEGFP—N1—hTERT的构建及鉴定.pdfVIP

· 2 · CL海畜牧兽医通讯》 2009年第6期 荧光真核表达载体pEOFP—NI—hTERT的构建及鉴定 梁榕 旺 赵 国琦 田智泉 李 艳 彭春燕 金晓君 (扬州大学动物科学与技术学院 江苏 扬州 225009) 【摘要 】采用限制性 内切酶 EeoRl和 Sal1双酶切质粒 pBABE—hygro—hq、ER—I，获取端粒酶催化亚基 (hTERT)。将其定向克隆至载体 pEGFP N1，构建重组 的荧光真核表达载体 pEGFP N1一hTERT。经双酶切 、测 序及转染成纤维细胞鉴定均证实hTERI、基 因已插入 pEGFP～N1载体 中，成功构建 了荧光真核表达栽体pEGFP— NI—hTERT。构建的 pE(~FP NI hq、ERq、，为进一步筛选 目的细胞和建立永生化细胞系奠定了基础u 关键词 ：hTERT；重组质 粒；永生化 端粒是位于染色体末端具有特殊功能 的DNA帽，其在 的基 因凝胶 ，称重并置于指形管中；加入 1／2倍体积的TBE 稳定染色体及防止染色体末端融合等方面具有重要的作用 缓冲液和 4．5倍体积的Binding溶液 ，55℃孵育 5rain，溶解 随着细胞分裂次数的增加 ．端粒进行性缩短，当缩短到一定 凝胶 ；加入 2 lSilicaPowder悬液 ，涡旋振荡器混匀 ，55℃孵 的限度即不能维持染色体的稳定时 ．细胞失去分裂增殖的能 育5rain．离心 5s．弃去上清液 ；加入冰预冷的DNA浓缩液 ， 力 ，进而衰老死亡 。端粒酶是催化合成并维持端粒一定序 涡旋振荡器混匀 ，离心 5s，弃去上清液 ，重复浓缩沉淀 3次 ， 列的核糖核蛋 白／2，由端粒 酶 RNA、端粒 蛋 白以及 hTERT 并吹干 10～ 15rain；加人无菌去离子水或 TE缓冲液洗脱 组成 ，具有逆转录酶的活性 其中，hTERT在端粒酶的启动 I)NA，55℃孵育 5rain，将上清液移入新 的指形管 ，并重复洗 中起关键作用[3,41。据报道 ，hTERT转染原f℃培养的上皮细 脱 DNA沉淀，回收上清液 ；回收的上清液即为载体和 目的基 胞 ，可获得具有永生性转化的上皮类型细胞 ’。因此 ，本研 因，取适量该上清液进行 0．8％琼脂糖凝胶 电泳鉴定 。 究拟采用重组质粒技术 ，构建荧光真核表达载体 pEGI~P— 1．24 pEGFP一-N1与 hTERT的连接 ：将 回收的 pEGFP— N1一hTERT，为进一步筛选 目的细胞和建立细胞系提供理 Nl与 hTERT进行定向连接 ．连接反应体系为：pEGFP—N1 论基础 。 O．2 g、hTERT0．6 g、l0×连接酶缓冲液 2 1、T4DNA连 1 材料与方法 接酶 0．5 l、无菌去离子水补足 20f』l，混匀，22℃水浴 16h。 1．1 材料 125 pEGFP N1hq、ERT重组 质粒 的筛选 及鉴定 ：取 11．1 质 粒、细 胞 ：pEGFP—Nl质 粒 (全 长 4700bp)， l0 “I连接产物于大肠杆菌 DH5a中转化 ．涂布含 100~g／ml pBABE—hygro～hTERT质粒 (全长 9058 ．hTERq、cDNA 的卡那霉素的LB琼脂平板 ．37℃培养 12h；挑取 3～4个单 长度为3500bp)，大肠杆菌 I)H5a及成纤维细胞均为扬州大学 菌落分别接种于7m1舍卡那霉素的 LB培养基 中，37℃摇床 动物科学与技术学院动物微生态营养与分子营养实验室保存。 培养 12～16h，所获得菌液采用试剂盒提取质粒 。采用限制 1．1．2 主要试剂：限制性 内切酶 EcoI~．I、Salf、T4DNA连 性内切酶 EcoR1、SalT对提取 的质粒进行酶切 ，0．8％琼脂 接酶、DNA胶回收试剂盒为 F