焦磷酸测序法检测结直肠癌患者kras基因突变.pdfVIP

·538· 主堡捡墅医堂盘盔垫!Q生垒旦筮翌鲞箜鱼魍￡!鱼』!生堑型：』!竖垫!Q：!!L塑：塑垒垒 ．临床实验诊断研究． 焦磷酸测序法检测结直肠癌患者k-ras基因突变 陈婕 郭兴中 朱凡邹媛 白法安 方国伟 研究证明，k-ra$癌基因的激活在CRC发生发展过程中 起重要作用…。k-ras基因最常见的激活方式为点突变，其物由英骏公司合成。引物序列为：k-ras正向引物：5’一 GCAGTCAACTGGAA邢CATG-3 中90％以上的突变发生在l号外显子第12位密码子(野生 型：GGT)和第13位密码子(野生型：GGC)拉’，突变率约 0．2ttmol／L，k·ra8正向引 30％一49％¨J。近年来，k-ms基因是否突变已成为西妥昔10×buffer(M矿+plus)5一，dNTP 单抗能否用于CRC分子靶向治疗的用药评判标准HJ。因 物和反向引物各10 pmol，Blend 1．25 此，如何快速准确检出k-ras基因突变对这类药物的应用及 U，DNA模板2 min； pl。PCR扩增条件：94℃预变性2 94℃30 疗效预测显得尤为重要。焦磷酸测序法是一种酶促级联测 s，55℃25S，72℃30s，共35个循环；72℃延伸 2 序技术，特别适用于SNP常规检测”1。本研究从少量新鲜 min。PCR产物431bp，经电泳确认后行焦磷酸测序分析。 组织或石蜡包埋组织和切片中提取基因组DNA，用高保真 5．焦磷酸测序分析：带生物素标记的PCR产物40m ID PCR法扩增k-ms基因片段，并用焦磷酸测序技术检测k-Y88用链球菌亲和素琼脂糖纯化，形成ssDNA。用PyroMark 基因的主要突变密码子，共检出8种突变类型，现报告如下。 system行焦磷酸测序，每个循环的核苷酸添加顺序为CTGA， 一、材料与方法 加2；tl测序引物pyro-seq(10p,mol／L)：5 1．标本来源：CRC肿瘤组织标本160份(男100份，女AGCT-3’。本试验设计引物的37端位于第11位密码子最后 60份，年龄31—86岁)由杭州地区各医院送检，并均经病理1个碱基，使焦磷酸测序可涵盖2个密码子所有可能出现的 突变(图1)。引物设计用DNAstar软件。 确诊为CRC，其中石蜡包埋组织切片(5～10ttm)119份．新 鲜组织4l份。石蜡切片，常温运输及保存。新鲜组织存于 95％酒精中常温运输，24h内送实验室后，立即提取DNA。 2．试剂与仪器：焦磷酸测序SNP试剂盒、链球菌亲和索 ID 96 MA)焦磷酸测序仪(瑞 琼脂糖和eyroMarksystem(PSQ 典BiotageAB公司)。 注：k-188．F、k．瑚一R为正反向扩增引物，其中反向引物用 3．核酸提取：(1)石蜡切片组织DNA提取：根据组织大 生物素标记；pyro-seq为焦磷酸测序引物 小，选取适营玻片。将玻片放人二甲苯中浸泡lrain；再将玻