第六章细胞的冻复苏与运输.pptVIP

 第六章  细胞的冻存、复苏与运输 细胞冷冻、复苏的发展历史简介 　 1776年，Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。 　 到了1900年前后，科学家基本上肯定了生物成分(如精子)能够在零下温度贮存的事实。 　 1949年，Polge等人发现了甘油对低温下贮存细胞的保护作用。 Luyet(1951)与Lovelock(1953)等多位学者发现电解质浓度增大是造成冷冻贮存细胞损伤的主要原因。 　 1959年，Lovelock等人发现了一种新的化学保护剂，这就是现在人们熟知的二甲基亚砜(DMSO)。 　 当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规性通用技术 ，贮存时间几乎是无限的。 　 一、培养物的冷冻保存与复苏原理 冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在加有冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70℃的超低温条件)，并在此温度下对其长期保存的过程。 复苏(thawing)：是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。 无论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。 细胞冻存时，存在两种损伤：冰晶损伤 　　　　　　　　　　　　　　溶质损伤 　 冰晶损伤：由于温度下降，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内、外结冰而致的细胞损伤被称为细胞的冰晶损伤。 冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。 　 　　　　　　　　　　　 溶质损伤：因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤。 　 细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便发生渗漏。 溶质损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重 如果在溶液中加入冷冻保护剂时，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。 保护机理： 冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成 ； 通过降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。 影响冷冻效果的因素有以下几点： 　1.冷冻速率 　 不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。 当冷冻速度过慢时:细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。 　 当冷冻速度过快时:细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。 2.冷冻保存温度： 液氮温度(-196℃)是目前最佳冷冻保存温度。 应用-70℃～-80℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。如-70℃冻存SNL细胞(一种小鼠成纤维细胞)，一个月内复苏，细胞存活率在90%以上；但一个月后，细胞存活率却降至50%左右；若时间再延长，细胞存活率更低甚至为零。 3.复温速率 复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。 一般来说复温速度越快越好。常规的做法是:在37℃ 水浴中，于1～2min内完成复温。 　 在冷冻复苏中遵循：慢冻速溶原则！ 在复苏时，一般以很快的速度升温，1～2min内恢 复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会 暴露在高浓度溶质的溶液中过长时间，从而无冰晶损伤 和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的 结构和功能。 4.冷冻保护剂：是指可以保护细胞免受冷冻损伤 的物质。 分为：渗透性：常用甘油、DMSO 　　　 非渗透性 甘油或二甲基亚砜这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。 保护机制:在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。 甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂