细胞固定剂对GFP发光特性影响的研究.pdfVIP

2010，Vo1．27No．12亿 与 生 物 Z程 Chemistry Bioengineering 细胞 固定剂对 GFP发光特性影响的研究 张广峰 ，陈祥贵 ，帅培强 ，林 琳 (1．西华大学生物工程 学院，四川 成都 610039；2．四川出入境检验检疫局 ，四川 成都 610041) 摘 要 ：为了筛选可用于保持绿色荧光蛋 白(GFP)发光特性 的细胞 固定剂 ，采用6种细胞 固定剂分别在室温和 4℃ 条件下对表达 GFP的HepG2细胞进行固定，然后在荧光显微镜下观察 GFP发光情况，并采用荧光酶标仪测定细胞荧 光值 。结果表 明，无论是在室温还是在 4℃条件下，95 乙醇、甲醇、5 冰醋酸、Carnoy固定液固定细胞后绿 色荧光迅速 消失，而丙酮和 4 多聚 甲醛 固定细胞后仍可保持足够强的绿色荧光 ，但保留的荧光强度随固定剂作用时间的延长和作 用温度的升高而降低。因此 ，对表达 GFP细胞进行固定时，宜选择丙酮和 4％多聚 甲醇作为 固定剂 ，并降低作用温度、缩 短作用时间，有利 于保持细胞的绿 色荧光 。 关键 词：细胞 固定剂 ；绿 色荧光蛋 白(GFP)；荧光 ；多聚甲醛；丙酮 中图分类号：Q814．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1672—5425(2010)12—0038—03 绿色荧光蛋 白(Greenfluorescentprotein，GFP)， 1．3 GFP在细胞中的表达 是生物医学研究中广泛应用的标记蛋 白，常 以融合蛋 贴壁 培养 的 HepG2细胞经 0．02 EDTA + 白的形式在哺乳动物细胞中表达 ，以观察 目标蛋 白在 0．25％胰酶消化后制备成单细胞悬液 ，铺于 96孔板 细胞中的移动和定位 。 上，每孔 200 L，37℃、5 C0 条件下培养 1d后 ，用 在很多研究中，需要对细胞进行 固定 以便进行后 表达 GFP的腺病毒 Ad-Pshuttle—CMV—GFP感染，感 续 的显微观察、探针杂交或免疫化学染色。但是细胞 染复数 (MOI)为 3O，48h后用荧光显微镜观察细胞发 固定过程中，固定剂选择不 当或者固定程序不合理可 光情况 ，当细胞 GFP阳性率达到 80 以上时，用于实 能导致 GFP荧光强度显著下降甚至荧光消失 ，从而不 验。以未经腺病毒感染的细胞作为对照。 能观察到 GFP的分布、定位及相关 的显微 结构变 1．4 细胞 固定 化 ]。因此 ，探索不 同细胞固定剂对 GFP发光特性的 将发光细胞 的培养液吸去 ，并用 PBS洗涤 2次， 影响 ，对指导相关的实验研究具有一定 的实际意义。 然后加入待试固定剂 200 L，按室温、4℃分别固定 5 l 实验 min、10min、15min、20min、25min、30min，固定后将 固定液 吸 出，然后用 PBS洗涤 3次。倒置显微镜 1．1 细胞 (LeicaDMILHC)观察 固定后发光情况并拍照 。 HepG2细胞 (ATCC HB-8065TM)购 于四川I大学 1．5 酶标仪测发光值 华西公共卫生学 院。HepG2细胞贴壁培养于 10 胎 经不同固定剂固定的 96孔板上细胞用荧光 ／化学 牛血清的DMEM／高糖培养基 ，培养条件为 37℃、5 发光酶标仪 (TECANF200)测发光值 (激发波长 485 CO 。一般 2～3d传代 1次。