肝癌细胞的研究进展.docVIP

乙肝细胞的研究进展 引言：据有关资料显示，全世界约有3亿乙型肝炎病毒感染者。中国占1亿人．且每年新增患者3000万以上。据1992年全国病毒性肝炎流行性调查，中国有6亿人曾感染过乙型肝炎病毒，其中1．2亿是乙肝表面抗原携带者。据统计，肝癌患者中乙型肝炎相关者约占70～80％。一般认为部分乙肝患者转变为肝癌的进程为：乙型肝炎一慢性肝炎一肝硬化一肝 癌【1】。故了解乙肝的发病机理及防治方法，掌握肝癌细胞 cDNA 文库的构建及鉴定方法显得尤为重要。 关键词：肝癌细胞；发病机理；防治方法；cDNA文库 1、乙肝的发病机理及病因 1．1乙肝的发病机理 这是一个复杂的问题，迄今尚未完全阐明。国内外学者对此进行了大量研究。结果表明，乙型肝炎病人的肝脏受损并不是乙型肝炎病毒在肝细胞内繁殖的直接结果．而是机体的免疫反应造成的。乙型肝炎病毒感染人体后，可激发机体产生对乙型肝炎病毒的各种细胞免疫反应和体液免疫反应，并激发自身免疫反应引起免疫调节功能紊乱。机体的这些免疫反应，可清除已感染病毒的肝细胞．又可引起肝细胞的损伤，造成不同类型的病理变化及临床转归。幼儿时的感染，常常因免疫功能不健全而缺乏上述的免疫反应，造成乙型肝炎病毒携带状态或慢性肝炎。 1．2乙肝的病因 病毒感染：乙肝病毒具有传染性强，传播途径复杂，流行面广泛，发病率高等特点；酗酒：酒精及其代谢产物对肝细胞的损害能引起肝炎。据研究，如果每天摄人酒精1509以上，持续5年以上．90％的人可发生各种肝损害：10年以上则有约34％发生慢性肝炎．约25％发展为肝硬化：药物或化学毒物：许多药物和化学毒物都可引起肝损害。如四氯化碳、四环素、砷汞等，造成药物性肝炎或中毒性肝炎。肝损程度取决于药物的剂量、时间。以及个体差异。长期服用或反复接触，可致慢性肝炎，甚至肝硬化【2】。 2、乙肝细胞 cDNA 文库的构建及鉴定 2. 1 材料 人肝癌细胞株HHCC， E.cOli Y1090hsdR 株，gt11 噬菌体去磷酸化的左、右臂DNA。 质粒 Bluescr ipt SK 及感受态细菌 TG1，TRIZOL试剂，OligoteX mRNA kit ，UniVersal Riboclone cDNA Synthesis kit， EXpandTM ReVerse Transcriptase， Lambda Packaging kit， [ O-32P]dCTP.。 2、2 方法 1、培养HHCC 至旺盛生长期，倾去培养液后加入 TRIZOL试剂，裂解细胞并抽提出总 RNA; 用OligoteX mRNA kit 试剂从总 RNA 中纯化出含 polyA 的 mRNA 并用紫外分光光度计( Perkin Elmer 公司产品D 测定其纯度及含量。 2、 以 6 g 的 mRNA 为模 板，3ug Oligo ( dTD 15为引物， Expand TM ReVerse Transcriptase 为反转录酶 ，42C 60 min 合成 cDNA第 1 链; 然后向其中加入 10 第 2 链缓冲液 再加入DNA 聚 合 酶 I 及 RNase~ 22C 保 温 60 min 合 成cDNA 第 2 链; 双 链 cDNA ( dscDNA D 合 成 后 加 入T4DNA 多 聚 酶 37C 保 温 10 min 削 平 双 链 cDNA的两端 以便于后续的连加人工接头反应. 在 cDNA第 1 2 链的合成过程中均取出一小份反应体系 加入[ O-32P ] dCTP 以 示 踪 cDNA 合 成 的 效 果. 用T4DNA 连 接 酶 将 EOORI 人 工 接 头 与 削 平 后 的dscDNA 连接 用 Sephacryl-S400 柱去除小于 500 bp的 cDNA 片段及游离的 EOORI 人工接头. 3、用 T4 多核苷酸激酶对连接上 cDNA 的人工接头磷酸化 然后再与去磷酸化的 7gt11 噬菌体左~ 右臂相连 连接体加入到噬菌体体外包装系统中 22C 保温 3 h 包装成噬菌体. 混合多份包装产物建成重组 7gt11 噬菌体文库. 4、取出 1 pL 的包装噬菌体 按 1 = 1000 和 1 =10 000倍稀释后感染对数生长期的 E. OO z Y1090 铺平板 并在上层培养基中加入终浓度为 5 g/L的IPTG 和 11 g / L的 X-Gal 37C 培养过夜 , 次日数噬斑数目及蓝~ 白噬斑之比 计算出文库的大小; 为了验证插入的 cDNA 片段的平均大小 我们将与构建文库用的同一批 cDNA 加上 EOORI 人工接头后 与经内切酶 EOORI 酶切并去磷酸化的质粒载体 Bluescr iptSK 相连 并转化感受态细菌 T