_分子生物讲义：第五章 基因诊断和基因治疗.ppt

第五章 基因诊断和基因治疗 基因诊断 应用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测分析致病基因的存在、变异和表达状态从而对疾病作出诊断的诊断技术 诊断技术进展 细胞学检查：第一代，早期 生化指标分析：第二代，50年代 免疫学诊断：第三代，60年代 以疾病的表型改变，如细胞形态结构 变化、生化代谢产物异常、特定蛋白质分子识别差异等为依据进行疾病诊断 基因诊断：第四代，70年代 直接以病理基因为探查对象 基因诊断 的优点 早期诊断 ：被检测的基因是否处于活化表达状态并不重要。因此，基因诊断不仅可对有表型出现的疾病作出明确诊断，它还可产前早期诊断遗传性疾病，可检出感染疾病潜伏期的病原微生物、还可能予测和早期发现某些恶性肿瘤。 灵敏度高 ：可从人类长达3×106kb的基因组中检测单拷贝基因，可检出某一基因的单碱基改变。 基因诊断的基本技术 一、核酸分子杂交技术 核酸分子杂交系指不同来源的两条互补核酸单链，在一定条件下形成双链分子的过程。核酸分子杂交发生于两条DNA单链之间者（ssDNA:ssDNA）叫DNA杂交。发生于RNA链与DNA单链之间者（RNA:ssDNA）叫做RNA-DNA杂交。将一段已知的带有标记物的核苷酸序列（核酸探针）与待测DNA/RNA杂交即可测知致病基因的存在状态。 （一）原位（in situ）杂交 不须提取DNA或RNA。直接用培养/采集的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固定载玻片上）和细菌菌落（复印至泸膜上）与标记核酸探针杂交。可测知特定基因的存在或表达状况。还可观察被测基因在细胞内或染色体上的定位。 （二）斑点印迹（Dot blot）杂交 把提取的DNA/RNA样本，直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜（下同）上与标记核酸探针杂交。可检测特定基因的存在或表达情况。 Southern印迹杂交 系将DNA经限制性酶切、凝胶电泳后，再转移至膜上与标记探针杂交的一种核酸分子杂交技术。其分析的特异性、敏感性、准确性俱佳。它可检出哺乳动物总基因组中的单拷贝基因。主要用于检测基因组中特定的基因或序列。 Northern印迹杂交 是把RNA经凝胶电泳转移至膜上与标记核酸探针杂交的技术。是分析基因表达水平的主要技术之一。它可定性、定量测知某一特定基因的表达情况。 二、PCR技术 （一）DNA PCR 以DNA为模板，扩增特定核苷酸序列。主要用于检测特定基因或DNA片段的存在。并常与核酸分子杂交结合，分析鉴定基因突变。 （二）RT-PCR 用提取的mRNA或总RNA（含mRNA）为模板，逆转、扩增cDNA。是检测特定基因表达水平的主要方法之一。也是用于鉴别、诊断RNA病毒的重要技术。 （三）PCR-SSCP 该技术是基于不同的单链DNA（即使只差一个碱基）有不同的空间构象，即DNA单链构象多态性(Singer Strand conformation polymorphysim,SSCP)。 这些不同构象的单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率是不同的。据此，将PCR扩增产物变性成单链DNA，经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可测知DNA碱基序列有无变异。 在基因诊断中它常与核酸序列分析配合完成基因突变分析。即先用PCR-SSCP进行大批量筛查。筛出有突变的样本（PCR产物）再测序即可明确该基因的突变性质。 （四）原位PCR 直接用组织切片和细胞进行PCR或RT-PCR反应，在组织、细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列。 既能鉴定含有靶DNA/RNA序列的细胞；又能确定靶DNA/RNA序列在细胞内或染色体上的位置。 （五）多重PCR 系在一次PCR反应中加入多对引物，同时扩增DNA链上不同序列段的一种PCR技术。主要用于一些“超大”基因中大片段缺失分析 。 DMD ：9对扩增引物加入一次PCR反应体系中，同时扩增9个外显子序列。由于扩增产物片段大小不一，只需琼脂糖凝胶电泳、EB染色即可直接观测有无某一外显子区带缺失。 是诊断基因缺失型的一种简便、快速、有效的基因诊断方法。 （六）定量PCR PCR产物经凝胶电泳分离转移至膜上，与同位素或化学发光标记的核酸探针杂交。根据放射自显影或化学发光后底片曝光的强弱，用密度计扫描定量。有条件者，PCR产物经凝胶电泳分离后勿须转移和杂交，直接于自动凝胶分析仪上扫描定量。最为简便、快速。定量PCR在基因诊断中也是应用较广，有时甚至是不可缺少的。 三、DNA序列分析 DNA测序是直接分析待测基因核苷酸序列的方法。是基因诊断中最为直观，准确可靠的技术。只是由于测序工作还较费时，经费亦较贵尚不能普遍应用。但随着DNA自动测序仪的快速发展和测序工作日趋商业化，将大大促进DNA测序的临床应用。 四、RFLPS分