第十二章DNARNA蛋白质.pptVIP

通过DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开。图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白。 离子交换层析： 离子交换是利用蛋白质表面的电荷与层析剂上的离子基团的静电作用。 第十二章DNA、RNA和蛋白质 DNA的基本操作：DNA（线状双链DNA）、ocDNA（开环双链DNA）、cccDNA（闭环双链DNA）。 DNA是相当稳定的，但是使用时也不能太随意，DNA的污染来源主要是其他DNA分子。 DNA保存： DNA在中性PH，低温，暗处，合适的盐浓度和无物理剪切的条件下较稳定 ，适宜保存。用于存放DNA的缓冲液有三种,TE，0.1×TE(适宜酶促反应)，T50E （适宜溶解PH不稳定的DNA）。 DNA检测： 1.紫外吸收 2.溴化乙锭（EBa） DNA浓缩： 1. DNA不溶于乙醇，所以一般用乙醇沉淀DNA来达到纯化的目的; 2.异丙醇沉淀； 3.有机溶剂浓缩DNA，如正丁醇。 DNA纯化： 1. 酚抽提（适宜样品DNA中混有蛋白质污染）；2.苯酚/氯仿/异戊醇抽提; 3.DEAE/纤维素交换树脂(其他杂质); 4.凝胶过滤(适宜除去样品中含有盐、缓冲液组分、小分子杂质等)。 DNA篇 1. DNA的分离： 质粒DNA的提取基本步骤： 1）质粒载体的选择； 2）培养细菌使质粒扩增；3）收集和裂解细胞。溶菌酶破坏细菌细胞壁，再同SDS和triton X-100可使细胞膜裂解，用强热或酸、碱处理后中和、复性就可以提取到质粒DNA。有煮沸裂解法、碱裂解法等。 噬菌体DNA的提取基本步骤：1）感染力的测定，一般用噬菌体裂解物感染大肠杆菌来计算感染力；2）从噬菌斑中回收噬菌体；3）增殖噬菌体；4）平板裂解液法；5）提取噬菌体DNA。 真核生物基因组DNA的提取基本步骤：1）破碎细胞；2）取出蛋白质、多糖、脂类等生物分子；3）取出盐类、有机溶剂等杂质；4）浓缩和溶解DNA。 2. DNA的转化 制备感受态细胞： 有CaCl2 法和电转化法。 转化主要步骤： 化冻、质粒与感受态细胞接触、热激，骤冷和目的基因的表达。 3.DNA的扩增：主要是PCR技术 4.DNA的重组：指将目的基因从这一载体插入到另一载体的过程。 目的DNA的准备。 载体准备 对目的DNA片段和载体磷酸化处理。 酶切完毕的DNA和载体连接。 连接DNA转入合适宿主菌，获取重组体。 筛选，检测重组体。 DNA重组过程中的注意点： 对于仅用限制酶处理的载体，与目的DNA连接的同时也能进行自我连接，因此有必要将载体DNA末端进行脱磷酸化处理，以防止载体自连。 如果载体和目的DNA不存在合适切点，这时候就需要对目的DNA或者载体进行修饰与改造。 RNA篇 RNA是单链分子，由A、U、C、G四个碱基串联在核糖-磷酸骨架上。由于核糖2’是-OH，遇水易发生变构，其结构不稳定。这种不稳定的变构反应在碱性条件下被加快。因此，RNA的长期保存是件令人头痛的工作。 细胞内外存在大量的RNase，对RNase 产生降解反应，且该酶极稳定，因此试验 中如何避免RNase污染时意见非常重要的工作。 RNA在合适的条件下易出现分子内局部配 对，这种配对导致RNA分子形状发生改变，因 此在普通电泳中不能正确显示其大小，所以应 用变性胶电泳，利用变性剂破坏其内部配对，使RNA表现为完整的单链状态。在PH6.0的微酸性环境下RNA相对稳定，碱性环境下易分解。 RNase无处不在。 细胞内存在大量的RNase，裂解细胞时应特别注意。 人的体液中含有大量的RNase，应尽量避免样品和样品管与体液的接触，养成戴手套和口罩的习惯，勤更换。 空气中的灰尘和细菌中含有大量的RNase，应建立干净的操作环境。 RNase的稳定性极高，即用蛋白质变性剂SDS或苯酚不能使之完全失活；其活性不依赖于金属离子，因此EDTA等螯合剂不能使之失活；热稳定，仅用煮沸方式也不能使之失活。 防止RNA酶污染一、防止RNA酶污染 的措施 1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要