第六章重组克隆载体引入受体细胞新.ppt

受体细胞的特性 具有接受外源DNA的能力 应为限制、修饰系统缺陷型 应为DNA重组缺陷型 不适于在人体内或非培养条件下生存 DNA不易转移 重组DNA进入受体细胞的途径 转化 转染 转导 转化-概念 受体菌直接接受来自供体菌的DNA片段，而能获得部分新的遗传性状的过程 把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程 转化-过程 感受态因子出现 → 与膜受体结合 → 特异性蛋 白质表达 → 细胞表面DNA结合蛋白及核酸酶裸露 → 双链DNA结合 → 双链DNA解链 → 单链DNA进入 感受态：细胞能从周围环境中吸取DNA的生 理状态 转化-人工转化常用方法 转染-概念 重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程 转导-概念 通过噬菌体为媒介，重组DNA进入受体细胞的过程 感染：噬菌体侵染宿主菌的过程 重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导 重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导—基本原理 无义突变：由于一对或几对碱基的改变而使决定某氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变 琥珀突变：密码子变为UAG的无义突变（amber mutation） Egene→E蛋白 λ噬菌体头部蛋白组成（占头部蛋白72%） Dgene D蛋白 噬菌体头部外侧蛋白（占头部蛋白20%） 第六章 重组克隆载体引入 受体细胞 基因工程的操作过程 切 接 转 增 检 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 大肠杆菌感受态细胞的制备： 100 mL 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体 用10 mL 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心收集菌体 用1 mL 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用 取100 mL 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温 2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 加入1 mL 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选 细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化 转化-人工转化常用方法 细菌原生质体的转化 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂 细菌原生质体的制备： 细菌原生质体的转化 取0.2 - 1mL的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10 - 20 mL DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀 细菌原生质体的转化： 细菌原生质体的再生： 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素 电穿孔转化 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大 转化-人工转化常用方法 基因枪法 显微注射法 λ噬菌体DNA的转染 感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5 吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟 转染裂解： 加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液 中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选 转染-过程 重组λDNA + 噬菌体头部蛋白+ 噬菌体尾部蛋白 成熟λ噬菌体颗粒 感染宿主细胞 包装 λ噬菌体A（Eam） ↓ 不能合成E蛋白 ↓ 不能形成头部结构 ↓ 寄主菌中大量积累尾部蛋