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用RT—PCR方法检测猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染 用RT—PCR方法检测猪瘟和猪繁殖与 呼吸综合征病毒混合感染① 王隆柏，周伦江，吴学敏，俞玉鸿，严山 (福建省农业科学院畜牧兽医研究所， 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建福州350013) 集肺脏、脾脏、淋巴结等材料，一20℃保存备用。 猪瘟(CSFV)又称烂肠瘟，是由黄病毒科瘟病毒 属成员之一的猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接 1．2工具酶和试剂PCR试剂盒(包括Taq酶、 Marker、Tr． 触性传染病，被OIE列为A类传染病，给养猪业造成dNTP、MgCl2等)、反转录酶MMLV、DNA 了重大的经济损失。目前，猪瘟在发病特点上，既有 izol试剂盒、蛋白酶K等均购自大连TAKARA公司。 高病死率的急性、典型猪瘟，又有持续感染的温和 1．3PRRSV引物和CSFV引物的设计和合成在 型、非典型猪瘟，以及无名高热或隐性猪瘟，因此， 参考CSFV和PRRSV美州株全基因序列基础上，利 6．0软件设计合成了一对扩增 凭借临床症状和病理变化给猪瘟诊断带来了一定的 用Primier5．0和Oligo 困难。猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and PRRSV的引物P3、P4，其片段大小为400bp。 respiratorysyndrome，PRRS)俗称“猪蓝耳病”， 是由PRRSV引起的一种以怀孕母猪的繁殖障碍和 ’ 新生仔猪呼吸道症状为特征的传染病。本病首先爆 一3 发于美国，随后传播到世界各地，给世界养猪业造 ’ 一3 成巨大的经济损失【l¨2。。我国1996年郭宝清等一。 首次从北京地区暴发流行的流产胎儿体内分离到 PRRSV，命名为ch一1a，从而证实了该病在我国的 3’ 存在。2011年3月，福建省某规模化猪场保育猪和 小猪出现消瘦、被毛粗乱、扎堆、呼吸困难、发热等现 以上引物均南大连TAKARA公司合成。 象。起初，该场误诊为是单一的猪瘟感染，紧急进行 1．4CSFV和PRRSVRNA提取 大剂量猪瘟疫苗免疫，但还是不能控制疾病的发展。 取病猪的肺、淋巴结、肾等组织，无菌条件下剪 根据临床症状、病理变化和实验室PCR技术等综合取约2g的组织病料，加入3倍体积的TE缓冲液研 诊断措施，最后确诊该猪场主要是由CSFV和 PRRSV混合感染所引起的，现将诊断结果报告如下。 1材料与方法 2min，室温静置15min后，于4。C12000rpm离心 1．1病料：该场送检的2头病猪，剖检观察后采15min。缓慢吸取上清600pL转入无菌小管中，加入 ①项目基金：2011年院“双百”行动项目(编号：sbmxll03—3) ·27· #建gf##E学套2011年学术年奢论i亲 等最异丙醇，一加℃静置30rain，12000rpm离心有些地方出现肉变或胰变，按压无弹性；病程长的与 15rain，弃去上清．加人200pL的70％乙醇进行洗胸膜、肋壁粘连，脑充血、小血。 涤，并于4℃12000rpm离心15rain，舟去L清，超净 2 2 音干燥25rain，用30p+LDEPC水溶解沉淀．20℃保