HPLCHPCE实验讲义与阅读思考材料.doc

实验课流程： 1. 交预习报告，2. 签到，3. 基础知识介绍，预设问题4. 配溶液。 5. 介绍仪器使用，6. 开始实验，7. 实验过程中不断提问，交流，交换实验。积极思考、探索实验中基本问题、主动使用程序、了解仪器原理的同学，在“预习提问”“基本操作”两栏（共40分）内给满分。循规蹈矩，按部就班的给25分。 8. 问题排除，学生亲自编写method，9. 实验结束，清洗烧杯、容量瓶。 10. 登记仪器使用情况。关闭仪器，打扫卫生。在成绩册上打分，老师在数据记录上签字后方可离开。 实验记录要求： 应包括目的、步骤、仪器型号、分离柱型号等。注意有效数字等。报告中可以讨论一两个实验课上的预设问题。完全按照书上回答的，在实验“报告”部分（共15份）给10分。有自己对实验问题的想法，即使科学性上有漏洞，给满分10分。  HPLC法 一、教学目标： 1. 认识HPLC的结构，熟悉HPLC操作 2. 了解HPLC进行分离、定性、定量的方法。 二、教学内容： 高效液相色谱（HPLC） 色谱分离的基本原理：组分在固定相与流动相中的分配系数不同。根据流动相不同，可以分为气相、液相色谱。液相色谱最为常见。 有机合成实验中常使用常规尺寸的硅胶柱：分离量大、分离度低、分离速度慢、只能对部分物质做半定量。提高分离效率、稳定性和定性、定量能力的办法：减小颗粒尺寸和粒径分布，增加管长度、均匀地填充固定相。但这些措施往往增加柱传质阻力。因此发展出使用微米级颗粒为固定相材料、泵驱动液体流动进行分离的方法即高效液相色谱法。 历史上有高压液相和高效液相之说。分析型色谱和制备型色谱的概念。我们主要学习分析型色谱。 三、仪器组成： 以我实验室分离二茂铁(Fc)标记的DNA溶液为例（上图右）。 HPLC系统一般应包括：流动相、泵、进样阀、分离柱、检测器直至废液瓶等部分。 溶液：可以是一种溶剂。或几种溶剂的固定配比。叫做“等度洗脱”。对于一些实验，往往需要两种以上溶剂并且连续调节流动相的配比，这叫“梯度洗脱”。梯度洗脱需要用两个以上的试剂瓶和两个泵。我们现有的两台HPLC，分别有一个和两个泵。今天的HPLC法测定水中扑热息痛含量实验将是一个等度洗脱的实验。所以两台仪器都符合实验要求。 泵：由于传质阻力大，为达到快速分离，必须使用泵驱动液体。 泵的种类：蠕动泵、螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵等。往复泵成为主流。如下图所示。 螺旋注射泵 往复泵工作原理 通道：～100um管道，稳定性好，能减小死体积、使用流体量小。 因为样品是存放在采样环中，通过转动阀体进入流路。因此，和气相色谱不同，使用HPLC时不需要快速注射样品。进样针采样量也不要很准，在我们实验中，由于采样环为20?L，因此进样针吸取溶液超过20uL都可以。因为实际采样是依靠进样环控制的，多注入的样品被直接排入废液小瓶。注意不要打入气泡。把阀旋转至“inject”的时候也不用很快，推倒底就可以。如果不推到底，液体被堵在进样阀里，压力会升高，可能导致泵、阀损坏。 分离柱：大多数固定相以多孔SiO2颗粒为基质，表面键和有机物或高分子材料。 如：C18柱就是以表面键和有十八(烷)基硅烷?m粒径的一种C18柱，属于中等粒径的分离柱。更小的粒径有3 ?m等。我们的分离柱已经可以分离一些性质比较接近的生物分子如具有不同碱基个数的DNA等，算是比较好的分离柱了。 检测器：我们使用的是最常用的紫外可见检测器。扑热息痛的最大吸收波长在254nm。高级的HPLC配有PDA（光电二极管阵列）检测器能同时给出物质光谱。 预设提问，在实验中一起讨论，点名回答，计分。 1：从HPLC最基本的原理讲，分离过程中流动相组成逐渐变化能够改变什么？告诉我们为什么梯度洗脱往往比等度洗脱效率高？（提示：从色谱基本原理出发） 2：HPLC中的泵应该具有什么样的性质才算是一台好的泵？ 3：流动相中进入颗粒状杂质会引起什么故障？怎样避免引入颗粒？ 4：微量进样器的使用还记得吗？如何驱除其中的气泡？ 5：什么是正向柱和反向柱？ 6：如果一个气泡进入色谱柱，对仪器是“致命”的损害吗？ 7：回忆HPLC检测器都可以是哪些？有什么特点？ 四、实验步骤 做色谱实验不能急，应该带护目镜（我们实验室没有配备）。眼睛不要过分靠近仪器管路和接口处。应该带手套（我们实验室没有配备）….我只能纸上谈兵介绍实验室安全知识了。 分别移取0.25、0.50、1.00、2.5、5 mL扑热息痛stock溶液（100ug/mL）至50mL容量瓶，用二次水定容。配制成0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 ug/mL的扑热息痛标准溶液。注意溶液应倒在干净的烧杯中然后用移液管量取，烧杯和移液管在使用前都应用储备液荡洗。其他操作遵循