HPLC实验报告.doc

水体中雌激素的高效液相色谱法分析 李甜甜 指导老师：凌婉婷 1 前言 目前, 环境内分泌干扰物( endocrine disrupting chemicals, EDCs) 被列为继臭氧层空洞和地球变暖之后的又一新的环境污染问题, 成为当前国际上研究的热点。至今所报道的各种内分泌干扰物中, 雌性天然激素及其合成激素被认为是最重要的干扰物之一。这些外源性化学物进入体内后通过和内源性雌激素相同的作用机制( 主要是核受体蛋白介导作用) 干扰内分泌系统而产生一系列的不良作用, 包括致癌、损伤生殖功能导致神经系统和免疫系统异常等。 环境中的雌激素主要是由人类和动物的新陈代谢而产生的，随着尿和粪便等排泄物而进入废水中，经过污水处理厂处理后进入到自然水体中，并在城市水系统中的固液相之间进行迁移和转化。再者，由于激素类药物在人类日常生活和养殖业中被大量使用，不同种类的雌激素因此会进入城市污水管网，经污水处理厂处理后，排放进入环境。EDCs 是城市水循环过程中长期存在的一类典型污染物，虽然其含量较低，但是在极低的浓度( ng·L-1 )水平下就能造成动物内分泌紊乱、雌性化、发育不良以及畸形化等不良影响，而且有可能和水体中残留的其他雌激素类物质发生协同作用, 因此这类物质对生态环境潜在的危害性是不可忽视的。同时由于EDCs 的亲脂和难降解特性，在城市水循环的过程中会逐渐积累，威胁到城市居民的身体健康，对生态环境存在潜在的危害性，已经成为城市环境保护的核心问题，急需针对城市水体中的EDCs 开展基础研究工作。因此在环境中建立一套科学、完善、高效的雌激素类物质检测方法是十分必要的。 近年来，随着色谱、质谱及色谱-质谱联用技术等的快速发展，微量雌激素类污染物的检测技术也随之有较快的发展。目前测定EDCs 的方法有GC- MS 法 、HPLC法, 荧光光度法 , 酶联免疫分析法(ELISA), 极谱法等。其中GC - MS 和HPLC是比较常用的方法。GC- MS 法需对样品进行酯化处理, 操作繁琐, 重复性差。本文采用固相萃取(SPE) 浓缩净化技术, 通过高效液相色谱(HPLC)分离, 荧光检测器进行定性定量分析, 建立了快捷、便利、有效的对水中内分泌干扰物EE2的测定方法, 并可在污水监测中得到应用。 2 实验材料 2.1 仪器与试剂 LC-20A高效液相色谱仪，RF-10AXL荧光检测器。色谱柱：Inertsil ODS-SP-C18（150mm×4.6mm,5μm）。固相萃取仪（HP-6019-12 SPE），圆周形氮气吹干仪，固相萃取柱（6mL）。 炔雌醇（2μg/mL,EE2），实验用水（超纯水），甲醇、乙腈均为HPLC级试剂。C18，玻璃棉。 2.2 标准溶液及模拟水样的配制 分别取2μg/mL EE2 0.25mL，0.5mL，1mL，2mL，5mL，7.5mL于棕色容量瓶中，并用甲醇稀释定容至10ml，摇匀，配制成不同浓度的标准溶液，保存待用。 取2μg/mL EE2 0.5mL于容量瓶中，用超纯水定容至100mL，摇匀，配制模拟水样，保存待用。 2.3 C18 SPE柱的制作 订制6ml固相萃取玻璃柱管，在柱管底部填入一定量的玻璃棉，称取0.2gC18填料加入柱管中，轻轻敲打柱身使其均匀，将填料填平、压实，上层再覆盖一层玻璃棉，再以清洁的玻璃棒按压使其装填紧密，保存待用。 2.4 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-SP-C18（150mm×4.6mm,5μm）；流动相为甲醇/乙腈/水（体积比为25:30:45）；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；进样量：20μL；荧光检测器波长：激发波长为280nm，发射波长为310nm。 2.5 样品的前处理 将配制好的100mL模拟水样以约为5~8mL/min的流速通过已分别用5.00mL甲醇和5.00mL超纯水活化的C18 SPE柱，用5.00mL超纯水淋洗柱体并继续抽吸3.0min，淋洗后的萃取柱用10.00mL甲醇洗脱，洗脱液收集至小试管中。将小试管置于40℃的恒温水浴并用氮吹仪缓慢吹干，然后加入50%甲醇水溶液将附着物重新溶解至2.00mL，通过0.22μm孔径滤膜后，用于HPLC/FLD分析。 3 结果与讨论 3.1 标准曲线 将配制好的浓度分别为0.05μg/mL，0.1μg/mL，0.2μg/mL，0.4μg/mL，1μg/mL，1.5μg/mL的EE2标准溶液，进样进行HPLC/FLD分析。 图1为标准EE2溶液的液相色谱- 荧光检测色谱图。 图1 标准溶液的色谱图 表1为标准溶液的荧光检测目标组分的峰面积（y）和目标组分相应的质量浓度（x，μg/mL）数据。 编号 01 02 03 04 05 06 07 y 0 249258 469437 91855