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HPLC实验报告.doc
水体中雌激素的高效液相色谱法分析
李甜甜 指导老师:凌婉婷
1 前言
目前, 环境内分泌干扰物( endocrine disrupting chemicals, EDCs) 被列为继臭氧层空洞和地球变暖之后的又一新的环境污染问题, 成为当前国际上研究的热点。至今所报道的各种内分泌干扰物中, 雌性天然激素及其合成激素被认为是最重要的干扰物之一。这些外源性化学物进入体内后通过和内源性雌激素相同的作用机制( 主要是核受体蛋白介导作用) 干扰内分泌系统而产生一系列的不良作用, 包括致癌、损伤生殖功能导致神经系统和免疫系统异常等。
环境中的雌激素主要是由人类和动物的新陈代谢而产生的,随着尿和粪便等排泄物而进入废水中,经过污水处理厂处理后进入到自然水体中,并在城市水系统中的固液相之间进行迁移和转化。再者,由于激素类药物在人类日常生活和养殖业中被大量使用,不同种类的雌激素因此会进入城市污水管网,经污水处理厂处理后,排放进入环境。EDCs 是城市水循环过程中长期存在的一类典型污染物,虽然其含量较低,但是在极低的浓度( ng·L-1 )水平下就能造成动物内分泌紊乱、雌性化、发育不良以及畸形化等不良影响,而且有可能和水体中残留的其他雌激素类物质发生协同作用, 因此这类物质对生态环境潜在的危害性是不可忽视的。同时由于EDCs 的亲脂和难降解特性,在城市水循环的过程中会逐渐积累,威胁到城市居民的身体健康,对生态环境存在潜在的危害性,已经成为城市环境保护的核心问题,急需针对城市水体中的EDCs 开展基础研究工作。因此在环境中建立一套科学、完善、高效的雌激素类物质检测方法是十分必要的。
近年来,随着色谱、质谱及色谱-质谱联用技术等的快速发展,微量雌激素类污染物的检测技术也随之有较快的发展。目前测定EDCs 的方法有GC- MS 法 、HPLC法, 荧光光度法 , 酶联免疫分析法(ELISA), 极谱法等。其中GC - MS 和HPLC是比较常用的方法。GC- MS 法需对样品进行酯化处理, 操作繁琐, 重复性差。本文采用固相萃取(SPE) 浓缩净化技术, 通过高效液相色谱(HPLC)分离, 荧光检测器进行定性定量分析, 建立了快捷、便利、有效的对水中内分泌干扰物EE2的测定方法, 并可在污水监测中得到应用。
2 实验材料
2.1 仪器与试剂
LC-20A高效液相色谱仪,RF-10AXL荧光检测器。色谱柱:Inertsil ODS-SP-C18(150mm×4.6mm,5μm)。固相萃取仪(HP-6019-12 SPE),圆周形氮气吹干仪,固相萃取柱(6mL)。
炔雌醇(2μg/mL,EE2),实验用水(超纯水),甲醇、乙腈均为HPLC级试剂。C18,玻璃棉。
2.2 标准溶液及模拟水样的配制
分别取2μg/mL EE2 0.25mL,0.5mL,1mL,2mL,5mL,7.5mL于棕色容量瓶中,并用甲醇稀释定容至10ml,摇匀,配制成不同浓度的标准溶液,保存待用。
取2μg/mL EE2 0.5mL于容量瓶中,用超纯水定容至100mL,摇匀,配制模拟水样,保存待用。
2.3 C18 SPE柱的制作
订制6ml固相萃取玻璃柱管,在柱管底部填入一定量的玻璃棉,称取0.2gC18填料加入柱管中,轻轻敲打柱身使其均匀,将填料填平、压实,上层再覆盖一层玻璃棉,再以清洁的玻璃棒按压使其装填紧密,保存待用。
2.4 色谱条件
色谱柱:Inertsil ODS-SP-C18(150mm×4.6mm,5μm);流动相为甲醇/乙腈/水(体积比为25:30:45);流速:1.0mL/min;柱温:40℃;进样量:20μL;荧光检测器波长:激发波长为280nm,发射波长为310nm。
2.5 样品的前处理
将配制好的100mL模拟水样以约为5~8mL/min的流速通过已分别用5.00mL甲醇和5.00mL超纯水活化的C18 SPE柱,用5.00mL超纯水淋洗柱体并继续抽吸3.0min,淋洗后的萃取柱用10.00mL甲醇洗脱,洗脱液收集至小试管中。将小试管置于40℃的恒温水浴并用氮吹仪缓慢吹干,然后加入50%甲醇水溶液将附着物重新溶解至2.00mL,通过0.22μm孔径滤膜后,用于HPLC/FLD分析。
3 结果与讨论
3.1 标准曲线
将配制好的浓度分别为0.05μg/mL,0.1μg/mL,0.2μg/mL,0.4μg/mL,1μg/mL,1.5μg/mL的EE2标准溶液,进样进行HPLC/FLD分析。
图1为标准EE2溶液的液相色谱- 荧光检测色谱图。
图1 标准溶液的色谱图
表1为标准溶液的荧光检测目标组分的峰面积(y)和目标组分相应的质量浓度(x,μg/mL)数据。
编号 01 02 03 04 05 06 07 y 0 249258 469437 91855
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