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HPLC实验讲义.doc
实验一 反相化学键合高效液相色谱法分析芳香族化合物
[目的要求]
1、了解高效液相色谱仪各部分的构造及功能。
2、掌握反相化学键合相色谱的基本原理。
3、学会简单样品的分析操作过程。
[基本原理]
高效液相色谱法以液体作为流动相,并采用颗粒极细的高效固定相的色谱分离技术,在基本理论方面与气相色谱没有显著不同,它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比,高效液相色谱对样品的适用性强,不受分析对象挥发性和热稳定性的限制,可以弥补气相色谱法的不足。
液相色谱根据固定相的性质可分为吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱、离子色谱、离子对色谱及空间排阻色谱等。其中反相化学键合相色谱应用最广,化学键合相色谱法是将有机分子通过化学反应键合到担体(多为硅胶)表面,从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相,则称为正相色谱;采用非极性键合相,极性流动相,则称为反相色谱。不同组分的分离基于它们在两相中的分配系数不同。
反相键合相色谱一般采用醇-水或腈-水体系作为流动相,纯水廉价易得,紫外吸收小,在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用较广泛的反相键合相是十八烷基键合相,即让十八烷基(C18H37―)键合到硅胶表面,这也就是我们通常所说的ODS(Octadecylsilyl)柱。
[仪器试剂]
Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪(带紫外检测器)
苯标准溶液:10%苯的甲醇溶液;甲苯标准溶液:10%甲苯的甲醇溶液;苯甲苯甲醇色谱[实验步骤]
一、测定前的准备工作
1.样品与流动相的处理
流动相一般应使用色谱纯,分析纯试剂需经过溶剂过滤器过滤(0.45 μm 的一次性过滤膜),纯有机相或含一定比例有机相的要用有机系的滤膜,水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。
2.更换泵头里清洗瓶中的清洗液
流动相不同,清洗液也不同,如果流动相为甲醇-水体系,可以用85%的甲醇水溶液;如果流动相含有电解质,通常用95%去离子水甚至高纯水。
如果仪器经常使用建议每周更换两次,如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。
3.排除泵内气泡
开关排气阀时泵一定要关掉。具体操作如下:
(1)在泵关闭的情况下,打开排气阀。
(2)选择要排气泡的通道,打开泵。
(3)按下泵前面板右下方的“Purge”键,仪器将以6.0 mL/min 的速度自动快速清洗泵内残留的气泡,5 分钟将自动停止。若想想手动停止,则再按再按“Purge”键,将停止清洗。
注意:使用快速清洗阀时,只能一个一个通道的排气泡,不得将几个通道同时按比例排气泡,比例阀的快速切换易导致损坏。流路中没有气泡后,将泵关掉,再关排气阀;排气阀不能拧的过紧,也不能拧的过松,拧得过松流动相容易从清洗阀部位流进泵头中引起报警。
4.设置柱温箱的温度
按住柱温箱上的“+”或“-”键,直到数字开始闪烁时设定温度。
5.系统的准备
(1)分析样品前先用甲醇,平衡活化色谱柱,并赶走管路中的杂质和水分。
(2)第1 步完成后,更换分析样品所需流动相冲洗流路约20 分钟,待基线走平后即可进样。
二、样品的HPLC分析
1.选择色谱条件)mL/min;
检测54nm;
2.苯甲苯定性分析
用微量注射器μL,在线观察记录保留时间,确定苯和甲苯的峰
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