酵母RNA的提取及组分鉴定.pptVIP

综合性实验四酵母RNA的提取及组分鉴定 一、目的与要求 了解RNA提取的原理，掌握RNA组分鉴定的方法 二、实验原理 酵母细胞中所含的核酸主要是RNA,DNA含量很少，故本实验采用酵母提取RNA。由于酵母细胞中所含的核蛋白不溶于水和稀酸，但能溶于稀碱，所以先用稀碱加热煮沸处理，使RNA成为可溶性的钠盐而与酵母中其它的成分分离。然后加乙醇沉淀溶液中的RNA，最后加酸将其完全水解，并用下列方法鉴定其中组分： (一) 钼酸铵试剂与无机磷酸结合生成的磷钼酸易被还原生成钼蓝，以鉴定核酸中的磷。 (二) 3,5-二羟基甲苯与核糖在浓酸中共热呈绿色，以鉴定核糖的存在。 (三) 嘌呤碱与硝酸银共热产生褐色的嘌呤银沉淀，以鉴定嘌呤的存在。 三、操作步骤 (一) 酵母中RNA的制备 1. 取0.5g干酵母置研钵中，加入0.04mol/L NaOH 4ml，磨3～5min，使其成匀浆； 2. 将酵母匀浆倒入1支大试管中，在沸水中加热30min； 3. 把大试管中匀浆分别放入2支小试管中，配平； 4. 2000r/min离心15min，将两上清液分别倒入另两小试管中，弃去沉淀； 5. 各加3mol/L HAc 2滴，立即摇匀酸化，用石蕊试纸检查。 6. 上述溶液猛力摇匀后，徐徐倒入两支各盛有2.5ml酸性乙醇的试管中，即有白色沉淀析出。 7. 2000r/min离心15min，倾去上清液，作下一步实验。 (二) RNA的水解 两管沉淀物中各加入1.5mol/L H2SO4 2.5ml后合并，沸水浴10min，使其充分水解。 (三) RNA组分鉴定（取试管3支编号） 1. 磷酸试验：1号管，取钼酸铵试剂10滴，加RNA水解液10滴摇匀，再加4%维生素C 6滴混匀后，置沸水浴中加热5～10min，观察颜色变化。 2. 核糖试验：2号管，取3,5-二羟基甲苯试剂6滴，加RNA水解液10滴摇匀后，置沸水浴中加热5～10min，观察颜色变化。 3. 嘌呤试验：3号管，取5% AgNO3 10滴，加氨水2-3滴（至沉淀消散后），再加RNA水解液10滴摇匀后，置沸水浴中加热约5～10min，观察颜色变化。 四、结果与计算 管号 1号 2号 3号 颜色 五、注意事项 (一) 酵母研磨要充分； (二) 沸水中加热时要时常摇动试管； (三) 硝酸银中加氨水应逐滴加入，白色沉淀消散后再加水解液。 ? ? ? 思考题 1．本实验为什么要选用酵母作为提取RNA的实验原料？ 2．实验过程中酵母细胞为什么要充分研磨？ * * * *