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电子显微和微量热法对已知产地蜂胶 抑菌机理的研究 摘要 微热量和电子显微对蜂胶抗菌作用模式的研究方法已应用于无乳链球菌。有研 究表明，蜂胶通过阻止细胞分裂来抑止细菌的生长，从而导致了的假多细胞的形 成。此外，蜂胶还破坏了细胞质、细胞膜、细胞壁、引起局部溶解，并且还抑止蛋 白的合成。很明显，蜂胶对细菌的抑止作用的机理是很复杂的，不能和典型的抗生 素的抑菌作用形成类比。 关键词 蜂胶 抑菌作用 溶菌作用 电子显微镜研究 微 热法 抑止蛋白合成 前言 蜂胶，一种由蜜蜂产生的天然树脂物质，广泛使用于耳鼻喉科、妇科、口腔 科、皮肤科的各种感染病的治疗中。蜂胶包含许多药学属性，例如抗细菌、抗真 菌、抗原生动物、抗病毒、抗炎症、免疫刺激活动。 蜂胶抗菌、抗炎症的特性归因于黄酮类物质如松属素、高良姜素、对香豆酸苄 酯、咖啡酸酯衍生物(1-4)，而局部麻醉活动归因于松属素、球松素和咖啡酸酯混 合物(5)。蜂胶通过提高脾脏中噬菌斑形成细胞的数量(6)来对细胞免疫造成刺激效 果。而哺乳动物组织再生归因于游离氨基酸的存在，例如精氨酸，它可以刺激有丝 分裂和提高蛋白的生物合成，而脯氨酸促进胶原弹性蛋白的组建(7)。此外由蜂胶 引起过敏性的变形性皮炎归因于肉桂酸酯(8)和咖啡酸酯(9)。 在先前的研究中，Simuth等人(10)在蜂胶抑制大肠杆菌和金色链霉菌的DNA 依赖RNA聚合酶类的过程中，证实了几个紫外吸收成分。因此，从这些已知成分来 讲，蜂胶对微生物的作用机理似乎变得更复杂。这个事实引导我们用电子显微和微 量热法的方法来研究蜂胶的抑菌模式。 材料及方法 蜂胶的提取 蜂胶于1991年采集于美因堡/上巴伐利亚（70%松柏类：欧洲冷杉、欧洲落叶 松、挪威云杉，30%混合林地：欧洲桤木、欧洲白桦、欧洲榛、欧洲山毛榉、黑 杨、英国栎、银白杨），并且收据可用。我们制出原蜂胶的乙醇溶液（25%v/v乙 醇）。蜂胶的乙醇提取物（EEP）包含：0.82%咖啡酸、1.24%对香豆酸、0.62%阿魏 酸、0.4%异阿魏酸、0.84%苯甲酸、3,4-二甲氧基肉桂酸，以及黄酮类物质和糖 类。黄酮的总含量为1.8%。白杨素、非瑟酮、高良姜素、木犀草苷、槲皮素都定 性存在。 细菌生长及实验环境 无乳链球菌，英国国家典型菌种保藏中心菌株8181 （NCTC）（Ⅱb型）来自于 中心公共实验室（伦敦），菌株58/59 （Ⅰa型）由J.Rotta博士（卫生和流行病 学研究所，布拉格）友情提供。以上两种菌接于胰酶解酪蛋白酵母浸膏肉汤麦芽糖 补足培养基中，于37℃、120rpm震荡培养。细菌的生长程度用PMQ3蔡司分度计于 660nm每小时测量一次，如果必要，样品可用培养基稀释。 取对数期的菌在浓度为A660=0.5制成10ml每份，并加入蜂胶的乙醇提取物进 行培养。这是乙醇提取物处理的起始点。将蜂胶的乙醇提取物加入到菌悬液中使得 终浓度为0.25、0.5和1.25μg/ml，于37℃震荡培养两小时。一组菌悬液加入 100μl25%乙醇作为对照控制。在培养末期，每组培养液中取5μl菌悬液涂于无蜂 胶的琼脂培养基中，于37%、5%二氧化碳环境中培养48h，以此检验不同浓度蜂胶 提取物作用下菌的再生能力。 十二烷基磺酸钠-丙烯酰胺凝胶电泳 根据Laemmli方法使用凝胶电泳分析细胞内的蛋白质，以及不同蜂胶浓度作 用下的由无乳链球菌分泌的蛋白质。（12） 微热量法 根据之前的报道（11），使用微热量法调查蜂胶对无乳链球菌的生长及新陈代 谢的影响。 电子显微镜检测 将对数期的菌液中加入蜂胶提取物使得终浓度为2.5μg/ml，培养4h。之后将菌 悬液于12000g、4℃离心10min （SorvallSS34离心机），并用0.1mol/mlpH=7.2 甲 次砷酸盐缓冲溶液进行冲洗。链球菌用2.5%戊二醇（Serva,Heidelberg,FRG）进行 固定以备镜检，随后用1.5%四氧化锇加上1.65%重铬酸钾在甲次砷酸盐缓冲溶液 于室温中固定一小时（13），之后用1%乙酸铀酰染色。在用乙醇梯度脱水之后， 将细菌样品嵌入伦敦白胶中。此切片由Reichert3超微切片机制成，之后用柠檬酸 铅染色（Reynolds,1963），用飞利浦EM400 电子显微镜与80kV进行检测。 结果 蜂胶提取物作用之后链球菌细胞的存活率 将对数生长期的无乳链球菌菌株8181 （Ⅱb型）和菌株58/59