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高效液相色谱法概述 高效液相色谱法的特点 本世纪60年代末期，高效液相色谱（HPLC）作为色谱分析法的一个重要分支，在传统液相色谱法和气相色谱法的基础上，逐渐发展成为一种新型的分离分析技术。50年代后期，由于色谱理论研究和实验技术的迅速发展，气相色谱法得到了越来越多的重视，而传统的液相色谱，包括柱色谱、薄层色谱以及纸色谱等，则仍然停留在经典的操作方式，其分析时间冗长，操作繁琐，耗费大量人力物力，因而未被重视。直到60年代以后，气相色谱法对高沸点有机物的分析局限性才逐渐使得人们重新认识到液相色谱法可以弥补气相色谱法的不足之处。此时随着色谱理论的发展，科研人员已经意识到将固定相微粒化是提高分离柱效的重要途径之一。伴随着微粒固定相的研制成功，仪器商们在借鉴了气相色谱仪研制经验的基础上，成功的制造了高压输液泵和高灵敏度检测器，传统的液相色谱法就此得到新生。 高效液相色谱法和传统的液相色谱法从原理上来说没有本质上的差别，只是由于它采用了新型高压输液泵、高效微粒固定相和高灵敏度的检测器，才使得它的各项检测性能远远优于传统液相色谱法。整个分析系统主要包括流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点做出很多调整。高效液相色谱的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了降低柱压，高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。经过近50年的发展，现在的高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面，不仅达到了气相色谱法的标准，而且在样品适用范围广、可以选择的流动相种类多和便于用做制备色谱的方面仍然保持了传统液相色谱法的优点。高效液相色谱法已经在生物工程、制药工业、食品工业、石油化工、环境监测等领域获得广泛的应用。 与传统的液相色谱法使用粗粒多空固定相、装填在大口径、长玻璃柱管内、仅靠重力驱动流动相不同，高效液相色谱法使用的是全多孔微粒固定相，将其装填在小口径、短的不锈钢柱管内，依靠高压输液泵驱动流动相通过色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度大大加快，从而可以在很短的分析时间内获得很高的柱效和强大的分离能力。 其主要特点为： （1）分离效能高 由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色谱填充柱的柱效可以高达5×103-3×104 块/m 理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱103块/m 理论塔板数的柱效。 （2）选择性好 由于液相色谱柱具有高柱效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性，因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合物及其同分异构体，还可以分析在性质上极为相似的旋光异构体，并且已经在高疗效的合成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重要的作用。 （3）检测灵敏度高 在高效液相色谱法中使用的检测器多都具有较高的灵敏度。比如被广泛使用的紫外吸收检测器，最小检出量可达10-9g，用于痕量分析的荧光检测器，最小检出量可达10-12g。 （4）分析速度快 由于高压输液泵的使用，相对于传统的液相色谱法，其分析时间大大缩短，当输液压力增加时，流动相流速也会相应加快，完成一个样品的分析时间仅仅需要几分钟到几十分钟。 （5）样品量少，容易回收 进样量通常只需要几微升到几十微升，样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 高效液相色谱法的分类 高效液相色谱法的分类方法很多。根据样品在固定相和流动相分离过程的物理化学原理，可以将高效液相色谱法分为以下五类： 一、吸附色谱（Adsorption Chromatography） 用固体吸附剂做固定相，以不同极性溶剂做流动相，根据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来进行分离。 吸附色谱固定相可以分为极性和非极性两大类，极性吸附剂主要包括硅胶、氧化铝、氧化镁、分子筛及聚酰胺等，其中最常用的吸附剂是硅胶。非极性吸附剂最常见的是活性碳。 对吸附色谱来讲，比较重要的是流动相的选择。一般对于流动相的要求主要是：选用的溶剂应当与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性；选用的溶剂应有高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变；选用的溶剂性能应与所使用的检测器相匹配，如果使用紫外吸收检测器，就不能选用在检测波长下有紫外吸收的溶剂；若使用示差折光检测器，就不能用梯度洗脱；选用的溶剂应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度；选用的溶剂应具有低的黏度和适当低的沸点；应尽量避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人员的安全。其选择的基本原则是极性大的样品用极性较强的流动相，极性小的样品则用低极性流动相。 二、分配色谱（Partition Chromatography） 用载带在固相基体上的固定液做固定相，用不同极性溶剂做流动相，根据样品中各组分在固定