大肠杆菌外膜蛋白酶T及其突变体的表达复性及生物活性分析.pdf

微生物学通报 SEP 20, 2011, 38(9): 1393−1399 Microbiology China © 2011 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@ 研究报告 大肠杆菌外膜蛋白酶 T 及其突变体的表达、 复性及生物活性分析 1 1 1 1 1 2 1* 刘晓露 惠长野 赵铁 彭亮 张文炳 黄胜和 曹虹 (1. 南方医科大学 公共卫生与热带医学学院微生物学系 广东 广州 510515) (2. 南加州大学 洛杉矶儿童医院 美国 洛杉矶 90027) 摘 要: 外膜蛋白酶T (Outer-membrane protease T, OmpT)是定位于大肠杆菌外膜, 具有高度底物 特异性的蛋白水解酶。本文旨在建立克隆表达膜蛋白 OmpT 和体外复性的方法, 考察其蛋白酶活 性。首先以大肠杆菌基因组DNA 为模板, PCR 扩增ompT 基因, 连接至pET28a (pET-ompT), 引入 点突变Asp85Ala, 构建表达质粒pET-ompT85 。然后将两种重组质粒转化入BL21 (DE3), 均以包 涵体形式大量表达。纯化后的蛋白经稀释法复性, 并加入粗制脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)恢 复蛋白酶活性。通过 SDS、鱼精蛋白水解试验及生长曲线观察表明, 重组蛋白OmpT 在体 外能水解抗菌肽鱼精蛋白和兔肌肉肌酸激酶, 而OmpT 突变体则无上述功能。上述结果表明本文 获得了具有蛋白水解酶功能的重组蛋白 OmpT, 该蛋白在体外可保护大肠杆菌抵抗鱼精蛋白的杀 菌作用。 关键词: 大肠杆菌, 外膜蛋白T, 突变体, 生物活性 Expression, refolding and characterization of Escherichia coli outer membrane T and its mutant LIU Xiao-Lu1 HUI Chang-Ye1 ZHAO Tie1 PENG Liang1 ZHANG Wen-Bing 1 2 1* HUANG Sheng-He CAO Hong (1. Department of Microbiology , School of Public Health and Tropical Medicine, Southern Medical University, Guangzhou, Guangdong 510515, China) (2. Children’s Hospital Los Angeles , University of Southern California, Los Angeles,