RNA的免疫共沉淀分离及检测.pdfVIP

中国细胞生物学学报 , 的免疫共沉淀分离及检测 苟兰涛 赵 爽 刘默芳 中国科学院 上海生命科学研究院生物化学 , 细胞生物学研究所 研究技术平台 ,上海 非编码 的发现使得 领域再次成为了生命科学研究关注 的焦点 。因为 是一种不稳定的生 物大分子 ,绝大多数 的 都需要与特定的 结合蛋 白质结合形成 刀 蛋 白复合物才能稳定存在于细胞 中 不仅如此 与 结合蛋 白之 间的动态关联贯穿和伴随了 的转录合成 、加工和修饰 、胞 内 运输和定位 、功能发挥及降解 的整个生命循环 。鉴于此 ,利用 结合蛋 白分离或发现鉴定功能性 分 子是 研究领域中一个不可或缺的研究方法 。简单地说 ,就是利用 结合蛋 白的抗体免疫沉淀 刀 蛋 白复合物 ,再从沉淀的 蛋 白复合物 中分离得到特定 结合蛋 白的 分离得到的 可 以通过末 端标记和变性胶 电泳对 分子的大小进行鉴定 , 也可 以利用高通量 测序方法对 序列进行分析 。 全部所用 的溶液试剂均经过 处理或 由 抗体混合液 中于 ℃旋转混匀 以上或过夜 。结 水配制 。 合时间也取决抗体本身 的质量和效率 。 抽提过种 中乙醇漂洗步骤可 以省略 。 将混匀液于 , 离心 , 弃上 样 品溶解与保存 清液 , 用冰浴冷 的低盐漂洗液洗 两次 , 每次 缓冲液 一 ℃ 如果下一步操作 , 冰上或 ℃进行 。随后再用高盐漂洗液洗 涉及酶反应 两次 , 每次 , 冰上或 ℃进行 。 一 而 如果下一步是 电泳 低盐漂洗液 高盐漂洗液使用 几 的 检测 熟练 的 操作非常重要 。 的污染可 比 一 , 刀 通过使用 处理操作环境得到 降低 。 比 , , , 由组织或细胞裂解液免疫沉淀 复合物 , 比 , 核糖核酸酶 可预先 照射组织和细胞 固定 刀 结合蛋 抑 制 剂 。 白复合物 。 ‘』、分子 的抽提 使用预先冰浴冷却 的 洗组织或细胞两 用 溶液重悬 , 消化 次 。 将裂解液加入组织样 品中进行匀浆 细胞样 品 再用常规 的 法抽提 ,用 乙醇沉淀 。 匀浆 步骤 可 省略 。 ’端标记和 电泳检测 裂解液 用 处理抽提得到 的 比 一 , , , 以去掉 ’端磷酸基 团 。 , , 】 , 几 经酚氯仿抽提和 乙醇沉淀后 , 使用 , 核糖核酸酶抑制