登革Ⅱ型病毒E蛋白Ⅰ、Ⅱ结构域在大肠杆菌中的表达及免疫反应性鉴定.pdfVIP

中国人兽共 患病学报 2012，28 (5) ChineseJourna1ofZoonoses 425 文章编号 ：1002—2694(2012)05—0425—04 登革 Ⅱ型病毒 E蛋 白I、Ⅱ 结构域在大肠杆菌中的表达及免疫反应性鉴定* 付 宇姣 ，郑学礼 摘 要 ：目的 在大肠杆菌 中表达登革 Ⅱ型病毒包膜糖蛋 白(E)的第一，二结构域 (DI／Ⅱ)并进行免疫反应性鉴定 。方 法 登革II型病毒接种乳鼠，提取总RNA，经 RT—PCR扩增 目的基 因片段 。双酶切 PCR纯化产物和质粒 pET～28a(+)并连 接构建重组质粒 pET28a—DV2一E—D12。筛选 阳性菌落，提取质粒并转化感受态细胞 ，IPTG诱导表达 目的蛋 白并进行 SDS- PAGE分析 ，Westernblot鉴定。结果 RT—PCR扩增得到约 900bp的 目的基 因片段 ，双酶切及测序分析表 明，插入序列正 确且开放读码框正确 。重组菌诱导后在 37kD位置有 明显 的诱导后表达带，其大小与预测值一致。经 12 SDS分析 ， 显示重组蛋 白主要以包涵体形式存在于沉淀中；Westernblot结果显示重组蛋 白与His·Tag单抗和登革病毒单抗 (DI一11)均 发生反应。结论 成功地在大肠杆菌中表达登革 II型病毒包膜糖蛋 白(E)的DI／Ⅱ，免疫反应性鉴定结果表明其具有 良好 的免疫反应性 。 关键词 ：登革病毒 ；E蛋 白；第 1-II结构域 ；表达 ；免疫印迹 中图分类号 ：R373．3 文献标识码 ：A Expression，purification and identificationofthedomains ofDENV IIenvelopproteininEscherichiacoli FU YU-jiao。ZHENGXue—li (DepartmentofPathogenicBiology，CollegeofPublicHealthandTropicalMedicine， SouthernMedicalUniversity，Ouangzhou510515，China) ABSTRACT：Inordertoexpressthedomain(D工，Ⅱ)ofDENV IIenvelopeproteininEscherichiaco[i，obtainthepuri— fledrecombinantproteinandidentifyitsimmunoreactivity，sucklingmicewereinoculatedwithliveDENV IIinthebrain．The totalRNA wasextractedfrom thebrainoftheinfectedmice，andtheenvelopeproteinDNA fragmentwasamplifiedbvRT- PCRandligated intopET一28atoconstructexpressionplasmid pET一28a(+ )一DV2一E．D12．Therecombinantplasmidwas transformedintoE．coliBL21(DE3)andinducedbyIPTG，andtheexpressedproductswereanalyzedbySDSandWest— ernblot．AfterRT—PCR amplification。aspecificDNA fragmentofabout900bpwasobtainedandligatedintopET-28atocon— structtheexpressionplasmidpET-28a(+ )一DV2一E-D1＆2．AfterinductionwithIPTG，aspecificproteinwitharelativemolec— ularmassof37000wasobtained．Aftertherecombinantstrainslysedbyortexingand