抗钠泵α2亚单位截断性片段多肽抗体的制备与鉴定.pdfVIP

·168 · doi 10.3969/j.issn. 1673-4254.2015.02.03 J South Med Univ, 2015, 35(2): 168-173 基础研究 抗钠泵抗钠泵αα22 亚单位截断性片段多肽抗体的制备与鉴定亚单位截断性片段多肽抗体的制备与鉴定 张明娟，张美程，朱参战，张超英，段宗明 西安交通大学医学院第二附属医院心内科，陕西 西安 710004 摘要：目的采用多肽制备技术和免疫学技术制备抗钠泵α2 亚单位截断性片段及其抗体，为检测和研究钠泵α2 亚单位的组织学 分布及其功能研究提供实验基础。方法 根据NCBI-Genebank 获得大鼠钠泵α2 亚单位M 1~M2 膜外区截断性片段目的多肽 （LAAMEDEPSNDN），采用9-氟甲氧羰基（Fmoc）固相合成法合成目的多肽，并采用碳化二亚胺法制备出多肽与孔戚血蓝素复 合物，免疫新西兰大白兔，免疫4 次后获得抗血清，测定其效价。随后采用protein A 纯化IgG 抗体，并将其用于大鼠主动脉血管 平滑肌细胞钠泵α2 亚单的组织学检测。结果 （1）人工合成的大鼠钠泵α2 亚单位截断性片段长 13 氨基酸残基 （LAAMEDEPSNDN-C），理论相对分子质量：1408.48 ，质谱实测相对分子质量：1407.90 ；高效色谱分析纯度HPLC 纯度85.5% ； （2）ELISA 法检测免疫后兔子的抗血清效价均大于1∶512 000 ，蛋白A 亲和纯化获得亲和纯化抗体浓度为0.965 mg/ml ，按照1∶ 1000稀释（终浓度1 μg/ml），ELISA 检测抗体效价为1∶256 000 ；（3）该抗体按照1∶100~ 1∶200 稀释可用于免疫细胞学检测。结 论 成功制备高效价抗钠泵α2 亚单位截断性片段抗体可用于钠泵α2 亚单位的ELISA 和免疫细胞化学实验，为钠泵α2 亚单位的 组织细胞学检测和功能研究提供新的实验基础。 关键词：钠泵；钠泵α2 亚单位；多肽；抗体 Preparation and characterization of polyclonal antibodies against rat sodium pump alpha 2 subunit M1-M2 extra membrane fragment ZHANG Mingjuan, ZHANG Meicheng, ZHU Canzhan, ZHANG Chaoying, DUAN Zongming Department of Cardiology, Second Affiliated Hospital of Xi ’an Jiaotong University, Xian 710004, China Abstract: Objective To prepare polyclonal antibodies against sodium pump alpha 2 subunit M1-M2 extramembrane fragment (NKAα2 EM1) for studying the pathogenesis of hypertension. Methods According to the GenBank data, the amino acid sequence of NKAα2 EM1 was obtained and the target peptide (LAAMEDEPSNDN) was synthesized using a peptide synthesizer with Fmoc method and purified with high-performance liquid chromatography. The synthesized peptide was then coupled to KLH for immunizing New Zealand white rabbits for 4 times to obtain the antiserum. The IgG antibodies a