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分子生物学技术在动物检验检疫中的应用 PCR技术 摘要: 随着分子生物学技术的发展，它在很多领域都占有重要的地位和意义，其中PCR技术作为分子生物学技术的核心，发展迅速，也有很多衍生技术，其中，运用最广泛的就是荧光定量PCR技术和多重PCR技术，它们分别在病毒、致病菌等方面都有着多种作用和重要地位。PCR技术虽也有缺憾，但是随着分子生物学技术的发展，它动物检疫的应用会越来越广泛。 正文： 分子生物学的经典定义是：从分子水平研究生命活动及其规律的科学。而实际上当代的分子生物学，主要是研究生物大分子一核酸及其表达产物一蛋白质的结构、功能、遗传、调控、相互关系和相互作用的科学。其主要的研究对象是DNA和RNA。[1]自20世纪80年代中期分子生物学技术问世以来，这种以核酸生化为基础的新技术就逐渐成为动物检验检疫领域不可或缺的非常有价值重要手段之一。 目前，分子生物学技术已经广泛用于动物检验检疫领域，能够进行多种病原细菌、病毒、病原体的检测，还有食品中致病菌的检验，又能快速筛选检验各种兽药残留以及有毒有害物质，对当代人们生活做出了巨大贡献。现在运用最多的有聚合酶链反应(PCR)、核酸探针、基因芯片、生物传感器等技术，都有着重要的意义。 分子生物学技术的核心是PCR，能在最短的间内扩增，所以PCR技术又称体外扩增技术。PCR通过向反应管中加入特异性引物可同时鉴定出单种或多种病原体，即便存在大量死菌也能得到准确结果，不受混合标本和微生物生长时间的限制。[2]这决定了其优越性。加之，PCR技术用于病原微生物检验术与传统的培养鉴定、免疫测定相比，其具有高的敏感性，较短的耗时和更广的适用范围。这种高度灵敏性和良好的特异性，受到了人们的高度重视，现在几乎已应用于基础研究的各个领域，并且成为医学临床和检验部门强有力的分析工具。并在动物检疫中发挥着越来越大的作用。已有各种衍生技术如荧光定量PCR、多重PCR、PCR单链构象多态性、反转录PCR等。[3] PCR技术能用于多种病毒、病原体、致病菌的检测，如人类免疫缺陷病毒（HIV）、肝炎病毒、肠出血性大肠埃希菌等。其中荧光定量PCR既可以用于临床感染性疾病的诊断，又可用于监测其疗效，如对结核杆菌、巨细胞病毒、流感病毒A、流感病毒B所引起的严重疾病的临床诊断、治疗、监测和预后评估，[4]对肿瘤的诊断、预后判断，是一种简便、快捷、准确的方法。它还能检测多种食源性致病菌，如沙门氏菌、单细胞增生李斯特菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠埃希氏菌等。现在也成功开发出了很多致病菌的PCR快速检测试剂盒，其基本原理是用PCR来快速检测病原菌特异性的靶基因。通过检测最终扩增结果而判断是否有足够量的靶基因存在。[5] 除荧光定量PCR之外，另一个在动物检验检疫中被用最多的PCR技术就是多重PCR技术。多重PCR是在常规PCR的基础上发展而来的。因此其基本原理和常规PCR没有差别，所不同的是多重PCR技术是在同一个体系中加入多对引物，同时检测多个目标序列的存在。[6]多重PCR在动物中使用相当普遍，主要用于病原体强弱毒株的区分、鉴别诊断和分型鉴定等，如对新城疫毒株强弱的检测、对禽流感的鉴别诊断、对猪链球菌的分型鉴定。多重PCR技术在食品致病菌检测中也已建立，程晓艳[7]等人已经建立了5种食源性致病菌多重PCR检测方法。对副溶血弧菌、沙门氏菌、单细胞增生李斯特菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌用多重PCR进行检测，并验证了此体系有很好的可靠性和实用性。 虽然PCR技术在动物检验、科学研究、临床医学等多个领域的重要性和绝对性地位毋庸置疑且深得人心，但他也是有缺点与不足的。我们可以在对病原微生物一无所知的情况下，采用PCR相关技术解决鉴定问题。PCR检测因标本用量少、直接针对微生物特异DNA片段以及无需培养再现病原体等特点而受青睐。我们可利用定性和定量PCR分别以电泳片段和PCR反应的拷贝数作为判断标准。[8]然而，PCR技术本身的缺陷造成的假阳性或假阴性结果，如引物设计、试剂质量、操作技巧和实验室污染等也会造成应用上的障碍。如对于感染性病原体的检疫,由于缺乏对核酸扩增检验技术完整深入的了解 ,以及缺乏相应地质量保证措施 ,导致部分实验室检验结果有很大的主观性和随意性 ,假阳性和假阴性较为常见。在病毒检疫中，RNA病毒的快速变异使我们无法知道下一个突变发生在什么地方，如果新的毒株在我们的检测区域发生突变，就可能出现漏检现象。特别是荧光PCR技术，如果在探针位置出现不匹配，检测很可能出现假阴性。在食品致病菌检验中，更要注意到食品中各种影响因子的作用，防止出现假阴性和假阳性。 现在的分子生物学技术仍在探索与进步中，虽然还不能解决所有缺憾，但是技术会一直进步，一直完善，分子生物学在动物检疫中的应用也