实验五 动物肝脏中DNA的提取.docVIP

课程名称： 生物制药技术实验 第 4单元（节）， 4 学时，授课时间2010 年12月1日，地点 201 项目/主题： 实验五 动物肝脏中DNA的提取 能力目标： 掌握动物肝脏中DNA的提取基本知识 知识目标： 掌握动物肝脏中DNA的提取原理和操作。 重点难点与解决方案： 各步操作要准确，减少中途核酸的流失。演示解决 教材、参考资料与媒体： 自编教材，参考网络上的一些相关知识 教学条件（环境）：100分钟讲授，30分钟演示、110分钟巡回指导和学生操作 一、实验目的 学习和掌握用盐析法从动物组织中提取DNA的原理与技术。 二、实验原理 核酸和蛋白质在生物中以核蛋白的形成存在，其中DNA主要存在于细胞核中RNA主要存在于核仁及胞质中，在制备核酸时应防止过酸、过碱及其他能引起核酸降解的因素的作用。全部操作过程应在低温下（4℃）进行，必要时还要加入栈抑制剂。如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸（EDTA）等可以抑制DNA酶活性，皂土可抑制RNA酶活性，同时SDS或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解破坏。 动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液（如1mol/LNaCl），但在0.14mol/L的盐溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核蛋白从样品中分别抽提出来。 将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿—异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。 三、实验试剂 1．0.14mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液（pH6.8）。 2．0.015mol/LNaCl-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液：氯化钠0.828g及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。 3．95%乙醇（A. R.）。 4．NaCl固体（A. R.）。 5．5%SDS溶液：5gSDS溶于100ml水中。 6．氯仿（A. R.）。 V（氯仿）：V（异戊醇）混合液20：1。 四、实验器材 1．猪肝 2．匀浆器 3．量筒 50ml(×1)、100ml(×1) 4．离心机(5000r/min) 5．离心管 6．试管及试管架 7．吸管0.50ml(×2)、1.0ml(×2) 、2.0ml(×2) 、5.0ml(×1) 五、操作 1．称取猪肝8g，用匀浆器磨碎（冰浴），加入相当于2倍肝重的0.14mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min下离心10min；沉淀中再加入25ml缓冲液，于4000r/min离心20min；取沉淀。 在上述沉淀中加入40ml/0.14mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液、20mlCHCl3-异戊醇混合液、4ml 5%SDS溶液使其终浓度为0.14%,振摇30min，然后缓慢加固体NaCl，使其终浓度为1mol/L（约3.6g）。将上述混合液在3500r/min离心20min，取上清水相。 3．在上述水相溶液中加入等体积95%乙醇，边加边用玻璃棒慢慢搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNA粗品。 4．提纯 将上述所得的DNA粗品置于20ml0.015mol/LnaCl-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中，加入1倍体积的氯仿异戊醇混合液，振摇10min，离心4000r/min,10min，倾出上层液（沉淀弃去），加入1.5倍体积95%乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步骤重复一次。最后所得沉淀用无水乙醇洗涤2次，真空干燥。 学习成果评价： 大部分同学弄清了DNA的制备的基本知识和操作，三分之二以上的学生都得到了理想的DNA粗品，达到了实验的目的。 教学小结： 大部分同学的弄清了DNA的制备的基本知识和操作以及原理 教师签名：陈辉芳 2010年12月1日 教案检查记录： 检查者签名（盖章） 年 月 日 课程单元设计 第1页（共3页）