用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞.pdfVIP

中国试剂网 3.13.11.8 用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞 下面的简单方案是Clhen 等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受 态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生5x106-2x107 个转化菌落，这 样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于 大多数大肠杆菌菌株，并且比方案Ｉ快速，重复性更好。该法制备的感受态细胞 可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。 １）从于37℃培养16-20 小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm ）， 转到一个含有100ml LB 或SOB 培养基的1L 烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约３ 小时（旋转摇床，300 转/分）。为得到有效转化，活细胞数不应超过108 细胞ml ， 可每隔20-30 分种测量OD600 值来监测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间， ＯＤ600 值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大 肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600 值，并将各黧度的增 减物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度 读数得到标化。 ２）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml 聚 丙烯管（Falcon 2070 ）中，在冰上放置10 分钟，使培养物冷却至０℃。切记： 下述所有步骤均需无菌操作。 ３）于４℃用Sorvall GS3 转头（或与其相当的转头）以4000 转/分离心10 分钟， 以回收细胞。 ４）倒出培养液，将管倒置１分钏以使最后残留的痕量培养液流尽。 ５）以10ml 用冰预冷的0.1mol/L CaCl2 重悬每份沉淀，放置于冰浴上。我们发 现将１mol/L CaCl2 贮存液[用纯水（Ｍille-Q 级或与其相当的级别）配制] 以10ml 小份贮存于-20℃煞是方便。制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至 100mlk，用Nalgene 滤器（0.45 μm 孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。对 于大多数大肠肝菌菌株（除ＭＣ1061 外），在这一步采用TFB （见表1.3）代替 氯化钙可得到相同的或更好的结果。 ６）于４℃以4000 转/分离心10 分钟，以回收细胞。 ７）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。 ８）每50ml 初始培养物用2ml 用冰预冷的0.1mol/L CaCl2[或ＴＦＢ，见表 1.3 中国试剂网 3.13.11.8 和步骤５）注]重悬每份细胞沉淀。此时，可将细胞分成小份，放于-70℃冻存[有 关讨论请参见53 页本节（二）步骤11)b.c)]。在这些条件下，尽管长期保存后转 化效率会稍有下降，但细胞仍可保持处于感受态。Dagert 和Ehrlich(1979) 曾表明 细胞可以于４℃在CaCl2 溶液中保存24-48 小时，在贮存的最初12-24 小时内， 转化效率增加３－５倍，然后降低到初始水平。 ９）用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200 μl 转移到无菌的微量 离心管中，每管加ＤＮＡ（体积∞10 μl, ＤＮＡ∞50ng ），轻轻旋转以混匀内容物， 在冰中放置30 分钟。 10）将管放到预加温到42 ℃的循环水浴中放好的试管回上，恰恰放置90 秒，不 要摇动试管。 11）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却１－２分钟。 12）每管加800 μl ＳＯＣ培养基（见附录Ａ）。用水溶将培养基加温至37℃，然 后将管转移到37℃摇床上，温育45 分钟细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素 抗性标记基因。如果要求更高的转化效率，在复苏期中，应温和地摇动细胞（转 速不超过225 转/分）。 13）将适当体积（每个90mm 平板可达 200 μl ）已转化的感受态细胞转移到含 20mmol/L MgSO4 和相应抗生素的ＳＯＢ琼脂培养基上。如培养物体积太小（〈10 μl ）。可再加肉汤培养基，用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平 板表面。如在一个90mm 平板上铺200 μl 以上的感受态细胞，应离心浓缩细胞， 然后用适量ＳＯＣ轻轻重悬细胞。如用四环素抗性作为选择标记，全部的转化混