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酸性蛋白酶催化合成蔗糖乙酸酯 单昱东，钱俊青 浙江工业大学药学院，浙江杭州310014 摘要：蔗糖酯中的蔗糖．6．乙酸酯是原酸酯法合成三氯蔗糖的重要中间体。而三氯 蔗糖是一种新型非营养型甜味剂，市场前景广阔。因此，对于蔗糖一6一乙酸酯的合 成进行研究具有广阔的应用前景。为了探索酶催化选择性合成蔗糖．6一乙酸酯的反 应体系及工艺参数，本论文探索了微水相体系中酸性蛋白酶催化蔗糖与乙酸乙烯 酯的转酯化反应。得到了酯化能力和选择性都较好的反应介质：四氢呋哺／醋酸． 醋酸钠缓冲液体系，pH为5．4，离子浓度为0．3mol／L，其中缓冲液体积含量为3％， 蔗糖，每0．689蔗糖可得蔗糖乙酸酯30．46x10。g，蔗糖一6一乙酸酯占总酯的比例可 达61．58％。 关键词：酸性蛋白酶，蔗糖乙酸酯，酯化 引言 蔗糖酯中的蔗糖．6．乙酸酯是原酸酯法合成三氯蔗糖的重要中间体。而三氯蔗 糖是一种新型非营养型甜味剂，甜度为蔗糖的600倍，在人体内几乎不被吸收， 热量值为零，是肥胖症、心血管病和糖尿病患者理想的辅助治疗产品，因此它在 医药中的应用不断扩大【l捌。美国、加拿大等许多国家早已批准使用，我国也于1997 年7月1日起批准使用，市场前景广阔【31。而至今，世界上只有英国Tate Lyle公 司和美国Johnson公司联合实现了三氯蔗糖的工业化生产，虽然其专利保护已到 期，但他们的对生产技术尤其是核心步骤与工艺参数秘而不宣。因此，对于蔗糖．6． 乙酸酯的合成进行研究具有广阔的应用前景【21。 鉴于其广泛而重要的用途，蔗糖酯的合成技术成为目前相关研究领域的一个 热点。现有的合成方法有化学法和酶法。化学法多利用蔗糖直接酯化的方法，由 于蔗糖有8个反应活性相近的羟基，所以酯化反应作用位点难以控制，欲得到特 定位点酯化的单一产物十分困难，往往需要冗长的保护和去保护步骤，同时生成 有颜色的副产物并带来不同程度的环境污染【1】。 以上诸多弊端促使越来越多的学者将研究重点转向酶法合成，而酶法合成则 由于其反应的专一性和条件的温和性等诸多优点而被广泛地研究和采用，显示了 强大的发展潜力和广阔的应用前景。 目前，国内外关于酶选择性催化合成蔗糖乙酸酯的研究报道多集中在脂肪酶 上，蛋白酶选择性催化合成蔗糖乙酸酯的研究还鲜有报道。根据蛋白酶催化的热 力学控制与动力学控制酶促合成机理【4】，我们认为，在有机溶剂中蛋白酶催化合成 蔗糖．6．乙酸酯是完全可能的。与脂肪酶相比，蛋白酶的成本较低，而且毗啶、DMF 等容易使脂肪酶失活的有机溶剂对蛋白酶几乎没有影响【51，也使得在溶剂选择上 有更广阔的空间。 本论文探索了微水环境中酸性蛋白酶催化蔗糖和乙酸乙烯酯的酯化反应，探 索了不同有机溶剂及各工艺参数对反应的影响。 1．实验部分 1．1材料与方法 1．1．1主要试剂及仪器： 蔗糖及所有有机溶剂均为市售分析纯；酸性蛋白酶(50000U／曲购于湖州礼来 1200高效液相色谱仪； 生物技术有限公司；TH2．82A型恒温水浴振荡器；Agilent Alltech 3300蒸发光检测仪(ELSD)。 1．1．2蔗糖乙酸酯合成方法 在50mL的具塞磨口三角瓶中加入一定量的蔗糖和酶，用移液管按顺序定量移 入缓冲液、有机溶剂以及乙酸乙烯酯，并置于摇床内震荡反应，反应结束后反应 液用聚偏氟乙烯微孔滤膜滤去悬浮的酶颗粒等杂质，用HPLC—ELSD进行分析，每 组实验两个平行，同时做空白对照。 1．1．3产物定量分析方法 色 产物分析采用高效液相色谱(HPLC)分离，蒸发光检测器检测(ELSD)。 蒸发光检测器温度85。C，氮气流速1．5L／rain。样品经色谱柱分离流入检测后，溶 剂雾化，其中溶质形成气溶胶，检测器响应产生信号，记录色谱图。 配置不同浓度的蔗糖标准溶液，同样的液相条件进样，记录色谱图，绘制蔗 糖溶液标准曲线，将蔗糖及产物峰面积对应蔗糖标准曲线算出质量。 1．1．4计算方法 以蔗糖作为内标：