第四节 单链丝状噬菌体载体.docVIP

第四节 单链丝状噬菌体载体 一、M13 噬菌体的生物学1．M13 噬菌体的组成和结构M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成 （GenBank 注册号为 V00604） 。基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 以及基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因 Ⅱ，Ⅴ 和 Ⅹ），形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ 和 Ⅺ），结构蛋白（基因 Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ 和 Ⅸ）。所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组 DNA 为正链，按基因 Ⅱ 至基因 Ⅳ 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。图 3-20 是 M13 噬菌体的遗传图谱。M13 噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长 880nm ，直径 6-7nm 。噬菌体颗粒的核心由 2700 个基因 Ⅷ 编码的结构蛋白呈管状排列而成（图 5-32），成熟的基因 Ⅷ 的产物为由 50 个氨基酸残基组成的 α 螺旋蛋白。顶端由 5 个基因 Ⅶ 和 5 个基因 Ⅸ 产物组成，作用于间隔区中的包装信号。 5 个基因 Ⅲ 蛋白和 5 个基因 Ⅵ 蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。图 3-21 是 M13 噬菌体结构模型。2．M13 噬菌体的增殖吸附是噬菌体感染的第一步， M13 噬菌体只感染具有性纤毛的菌株，携带 F 质粒的菌株可产生性纤毛。在吸附过程中，噬菌体的基因 Ⅲ 蛋白与性纤毛发生作用。随后丝状噬菌体穿入到性纤毛，基因 Ⅲ 蛋白与宿主的 TolQ 、TolR 和 TolA 蛋白发生作用，去除外壳蛋白，致使病毒 DNA 及附着于其上的基因 Ⅲ 蛋白进入宿主菌体内。在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA 。通过 θ 复制方式， RF DNA 进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。 M13 噬菌体在感染细胞中的复制见图 3-22 。当基因 Ⅱ 蛋白在亲代 RF DNA 的正链特定位点上产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制。此时，在大肠杆菌的 DNA 聚合酶 Ⅰ 的作用下，以负链为模板在切口的 3 末端加入核苷酸，并持续 DNA 的合成，用新合成的 DNA 替换原有的正链。当复制叉环绕模板整整一周时，被取代的正链由基因 Ⅱ 产物切去，经环化后形成单位长度的噬菌体基因组 DNA 。在感染开始的 15～20 分钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的作用下，又转变成 RF DNA ，然后以之为模板继续转录并继续合成子代正链 DNA 。当感染细胞内累计有 100-200 个 RF DNA 时，细胞内也产生了足够的单链 DNA 结合蛋白，即基因 Ⅴ 蛋白。该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因 Ⅱ mRNA 的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链 DNA 上，阻止其转化成 RF DNA 。此时， DNA 的合成几乎只产生子代正链 DNA 。另外，基因 Ⅹ 蛋白和基因 Ⅴ 蛋白也是噬菌体特异 DNA 合成的强力抑制子，从而限制感染细胞内 RF DNA 的数量。结果，感染细胞内 RF DNA 的数目和子代正链 DNA 的产生速率都能保持适度。成熟噬菌体颗粒由 11 个病毒蛋白中的 5 个组成，至少 4 个其他蛋白（如基因 Ⅰ 、Ⅳ 和 Ⅺ 蛋白，以及宿主的硫氧还蛋白（thioredoxin）对噬菌体颗粒的组装和分泌是必须的。 二、M13 噬菌体载体 单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNA。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。1．载体的插入位点在 M13 噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源 DNA（基因 Ⅱ/Ⅳ 和基因 Ⅷ/Ⅲ 之间） 。基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之间的 508bp 间隔区是主要的外源片段插入位点。在基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。基因 Ⅹ 也可用来