TCMicrosoftWord文档.docVIP

实验二十九 T细胞亚群的测定? (Assay for T cell subpopulations) ??? 人T淋巴细胞表面表达有CD3、CD4、CD8等多种分子，由此可将T细胞分为不同的亚群。通过检测这些分子可对T细胞及其亚群进行鉴定。常用的方法很多，归纳起来主要有：①免疫荧光法；②免疫酶标法，包括过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法，碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)桥联酶标法；③生物素-亲和素-辣根过氧化物酶(ABC)法；④免疫金银法(IGSS)等。 一、间接荧光免疫法 (Indirect fluorescence immunoassay) 【实验原理】 人T淋巴细胞表面均有CD3分子，按表达CD4和CD8分子的不同，可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞两大亚群。利用鼠源抗CD抗原单克隆抗体分别与淋巴细胞混合孵育，然后再加入荧光素标记的羊(或兔)抗鼠IgG第二抗体染色，在荧光显微镜下观察，计数荧光阳性细胞数并计算所占比率。 【主要试剂与器材】 1.鼠抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体。 2.FITC标记羊(或兔)抗鼠IgG抗体。 3.淋巴细胞分离液。 4.含2%BSA的无Ca2+、Mg2+Hanks液(pH7.2±0.2)。 5.荧光显微镜、水平离心机、Eppendorf微量管、吸管、试管、玻片等。 【操作方法】 1.取肝素抗凝静脉血2ml，用淋巴细胞分离液分离获取单个核细胞，以含2%BSA、无Ca2+、Mg2+Hanks液洗涤3次，重悬细胞并计数，调整细胞浓度至5×106/ml。 2.取4支Eppendorf微量离心管，每管加入上述淋巴细胞悬液50ml，然后分别加入适当稀释的抗CD3、CD4、CD8单抗各50ml，第4管加Hanks液50ml作为阴性对照，轻轻混匀，冰浴作用30min。 3.取出反应管，用Hanks液洗涤3次，弃上清，沉淀细胞每管加入适当稀释的FITC标记的羊(或兔)抗鼠IgG抗体(第二抗体)50ml，轻轻混匀，冰浴30min。 4.取出，同上洗涤3次，用Hanks液重悬细胞并恢复至50ml，取样滴于载玻片上，加盖玻片，在荧光显微镜下观察结果。 【结果判断】 先在普通光源下观察并计数视野中淋巴细胞总数，再用紫外光源计数同一视野中的荧光阳性细胞数，计算百分率。一般需计数200个淋巴细胞，分别统计CD3+、CD4+和CD8+细胞百分比，并计算CD4+/CD8+比值。 正常参考值：正常人外周血中CD3+T细胞60%～80%； CD4+T细胞35%～55%；CD8+T细胞20%～30%；CD4+/CD8+细胞比值为1.5～2.0。 【注意事项】 1.实验样品应新鲜，荧光染色后最好尽快观察，否则荧光强度会随时间延长而逐渐下降。 2.尽量减少非特异性荧光干扰。该法非特异性荧光来源较多，实验前应对各种抗体，尤其是第二抗体的浓度进行预实验，以确定最佳抗体浓度。 3.结果判定时，应注意观察阳性对照管，排除假阳性。 【应用与评价】 T细胞亚群的检测对观察机体细胞免疫功能有重要参考价值，而CD4+/CD8+比值对评价机体免疫调节功能亦有重要意义。该法是目前临床上检测T细胞亚群较为常用的方法。 该法特异性强，敏感性高，但样品不能长期保存，且结果判定易受主观因素影响。如在荧光染色后，采用流式细胞仪进行细胞计数，则可使结果更为准确、客观。 ? 二、APAAP法 (APAAP methA) 【实验原理】 碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)法是一种非标记抗体免疫酶组化染色法。该法检测T细胞亚群涉及三种抗体。第一抗体为鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体，可与待检细胞表面抗原结合；第三抗体为鼠抗碱性磷酸酶单克隆抗体，可与碱性磷酸酶结合成复合物；第二抗体为羊(或兔)抗鼠Ig，其Fab段可分别连接第一抗体和APAAP复合物，又称桥抗体。加入碱性磷酸酶催化底物显色，以此鉴定相应的表面抗原。 【主要试剂与器材】 1.APAAP T细胞亚群检测试剂盒? 包括鼠抗人CD3、CD4、CD8单抗各1瓶；羊(或兔)抗鼠Ig二抗1瓶；APAAP复合物1瓶；底物液1瓶等。 2.淋巴细胞分离液、Hanks液、0.01mol/L pH7.2PBS液。 3.水平离心机、显微镜、玻片、盖片、吸管等。 【操作方法】 1.样品的制备 ⑴常规方法分离外周血单个核细胞，洗涤离心后，将试管倒置，去除上清液。用剩余的少许液体将沉淀细胞混匀，制成细胞悬液。 ⑵取洁净玻片，用棉签取少许粘片剂均匀涂于玻片上，干后备用。 ⑶将细胞悬液滴于涂有一层粘片剂的玻片上，然后再回吸液滴，剩一薄层细胞，快速吹干；也可取悬液用推片制片。 2.样品的保存? 样品如不立即染色，放室温可保存3～5d。如需较长期保存，可在吹干后用铝铂纸包起来密闭防潮，最好放干燥箱内，然后置-20℃冰箱内，可保存