色谱法及其在生化分析中的应用3.pptVIP

亲和作用体系 特异性 亲和体系 高特异性 酶--底物、产物、抑制剂 抗原--单克隆抗体 荷尔蒙--受体蛋白 核酸--互补碱基链段 群特异性 免疫球蛋白--A蛋白、G蛋白 酶--辅酶 酶、蛋白质--过渡金属离子（Cu2+,Zn2+) 凝集素--糖、糖蛋白、细胞表面受体 配基（ligand)：亲和作用分子对中被固定在固体粒子上的分子。 L+E?E ·L 解离常数：Kd=[E][L]/[EL] 结合常数：Ka=1/Kd=[EL]/[E][L] 亲和体系的结合常数为104-108dm3/mol 亲和层析原理 亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法 亲和层析-操作过程 亲和配基 酶的抑制剂: 大豆胰蛋白酶抑制剂 抗体：抗体-抗原，Ka=107-1012。单抗免疫亲和层析 A蛋白：与免疫球蛋白IgG结合。 凝集素：与糖特异性结合的蛋白。伴刀豆球蛋白。 辅酶和磷酸腺苷：辅酶I，与脱氢酶，激酶结合。 三嗪类色素：分子内含三嗪环的合成活性染料。Reactive Blue 2 与脱氢酶，激酶结合。 过渡金属离子:Cu2+,Ni2+,Zn2+ 组氨酸: 咪唑环，静电和疏水作用。 肝素：哺乳动物的脏器内的酸性多糖物质。，与脂蛋白，脂肪酶抗凝血酶等结合。 亲和吸附介质 将亲和配基共价偶联在固体粒子表面（孔内）即可制备亲和吸附介质 具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度 含有可活化的反应基团 粒径均一的球形粒子 亲和配基固定化 亲和配基的固定化方法 介质的活化 溴化腈活化法：-NH2，在碱性条件下完成。 环氧基活化法： -NH2, -OH, -SH 直接固定法和间接固定法(氧化法，碳二亚胺法，戊二醛活化法) 硅胶的活化法: -OH，不宜在碱性条件下进行。 当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附; 随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附; 挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附; 随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。 2. 分配系数（ partion factor） K 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示，即： 分配系数是色谱分离的依据。 分配系数 K 的讨论 一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢； 试样一定时，K主要取决于固定相性质； 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。 3.分配比 （partion radio）k 在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比： 1. 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。 2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。 3. 分配比可以由实验测得。 分配比也称： 容量因子(capacity factor)；容量比(capacity factor)； 4. 容量因子与分配系数的关系 式中β为相比。 填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500。 容量因子越大，保留时间越长。 VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积； VS为固定相体积，对不同类型色谱柱， VS的含义不同； 气-液色谱柱： VS为固定液体积； 气-固色谱柱： VS为吸附剂表面容量； 5. 分配比与保留时间的关系 滞留因子（retardation factor）： us：组分在分离柱内的线速度；u：流动相在分离柱内的线速度；滞留因子RS也可以用质量分数ω表示： 若组分和流动相通过长度为L的分离柱，需要的时间分别为tR和tM，则： 由以上各式，可得： tR = tM(1+k) HPLC与GC异同点比较 不同点： 一、流动相不同：HPLC为液体流动相，GC为永久性气体作流动相（通常叫做载气） 二、进样器不同：高效液相为平头进样针，气相色谱为尖头进样针 三、色谱柱长不同： （1）气相色谱柱通常几米到几十米 （气相色谱由于载气的相对分