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iPLEX实验操作 一、引物设计 用mysequenom网上工具设计（步骤略） 二、扩增引物的稀释和UEP引物质量检测 合成回来的扩增引物加去离子水，稀释为100uM的储液。之后等体积混合使得终浓度为0.5uM。如做14个Plex的反应，共28条扩增引物。每条引物取1ul混合共28ul，再加入172ul的去离子水，总体积为200ul，即为引物Mix（0.5μM）。 合成回来的UEP引物按照“UEP引物稀释表”中的黄色高亮部分输入：ID号，Assay的命名，UEP引物的Mass，合成的管中的总OD量，总共有n 个Plex信息。根据表格计算出每个管中需要加的去离子水量，进行引物重溶。之后每个管中取等体积引物充分混合即为UEP Mix。 将前述UEP Mix 2ul加入40ul去离子水中混合。加入384孔板中，可用于直接点芯片，打质谱。这一步检测UEP的质量是必须的，如果质量不好必须重新设计。 三、DNA样品准备 基因组DNA样品应电泳检测完整性，并测浓度。用去离子水或Tris-Cl稀释为浓度10-20ng/ul。由于样品量大，必须做好样品标记。 四、PCR反应 在384孔板上一定要做好标记：横6，纵4的24个孔为一组。以一组为将来点样时候的一针。 按多出来10-15%的量来配制Mix，如需检测40个样，则配50-55个样的量 反应体系：均按ul计算 模板DNA(10ng/ul) 1 引物Mix（0.5μM） 0.1μM 1 10*Buffer（含Mg2+） 2mM MgCl2 0.5 MgCl2(25mM) 2mM 0.4 dNTP(25mM) 500μM 0.1 Hotstar(5U/μl) 1 Unit 0.1* 水 1.9 总量 5ul *如果做27个Plex以上的PCR，应用0.2 ul 在384孔板中每孔加入4ul Mix，最后在加入1ul模板DNA。 用ABI的PCR封口膜封紧，防止样品蒸发。本实验的每一步反应揭开PCR封口膜后都应该换一张新膜。 板子vertex后甩离。 在ABI9700 PCR仪上进行如下反应： 95度 2min （预变性）； 95度 30s 56度 30s 45个循环 72度 60s 72度 5min； 4 度 保存 反应结束时，取出384 PCR反应板。 五、SAP消化反应 前述PCR后的板子2000 rpm离心1min。 配制SAP酶Mix，按多出10-15%的量。 反应体系： SAP*Buffer 0.17 SAP Enzyme 0.3 水 1.53 总量 2ul 取2ul的Mix加入到每个孔中，来回吸打，保证混匀，将封口膜盖紧 在PCR仪中进行SAP酶消化： 37度 40min 85度 5 min 4 度 hold 消化完毕，取出384孔反应板，目测液体挥发情况。 六、单碱基延伸 SAP反应板放入离心机中2000rpm离心1min。 配制延伸Mix 27Plex 27Plex 终止引物Mix 0.94 0.94 Gold*Buffer 0.2 0.2 Termination mix 0.2 0.1 Enzyme 0.041 0.021 水 0.619 0.739 总量 2ul 2ul 取2ul的Mix加入到每个孔中，并来回吸打，保证混匀，将封口膜盖紧 甩离后，上ABI9700仪进行下列反应： 94度 30s 94度 5s 52度 5s 40个外部循环 80度 5s 72度 3min 4 度 hold 反应完毕，取出384反应板，目测液体挥发情况。 七、树脂纯化 384板2000rpm离心2min，每孔加16ul水。如有必要可再离心一次。 取一