雌、孕激素对子宫内膜癌Ishikawa细胞体外生长影响.pdf

中文摘要 雌、孕激素对子宫内膜癌Ishikawa细胞 体外生长的影响 摘 要 目的：子宫内膜癌是严重威胁广大妇女生命与健康的恶 性肿瘤，近年来子宫内膜癌的发病率逐年上升且趋于年轻 化，约25％的子宫内膜癌患者在绝经前发病，其中5％的患 者初次手术时年龄小于40岁，由于手术治疗切除了子宫及 双附件造成了人工绝经，这组患者患骨质疏松所致骨折和冠 心病的风险将增加三倍，她们将在体内无雌激素的条件下痛 苦的生存相当长的一段时期。从提高生活质量以避免因缺乏 雌激素相关疾病困扰的角度出发，应该进行激素替代治疗 (Hormone ReplacementTherapy,HRT)。但是，子宫内膜癌的 发生与无保护的雌激素过度刺激密切相关，即使切除了子 宫，外源性的雌激素是否会刺激隐匿的肿瘤细胞生长?因此， 子宫内膜癌术后患者应用HRT令人担忧。本研究在通过细 细胞体外增殖及调亡的影响，为临床子宫内膜癌术后患者可 否进行HRT及如何进行HRT，提供实验室依据。 方法： 1体外培养：常规方法复苏冻存的子宫内膜高分化腺癌 二氧化碳的饱和湿度培养箱内松盖培养。以O．25％胰蛋白酶 消化液消化传代。 2细胞增殖试验：取对数生长期细胞，经0．25％胰蛋白 中文摘要 酶消化液消化后，加入培养液吹打均匀，以3x104／ml细胞浓 度接种于96孔培养板，每孔加入200ul细胞悬液。培养24h 后加入经无血清培养液稀释的药物至终浓度为实验浓度，Ez 浓度为0．5×lo-5、10～、O．5x104、104mol／l，E2+P组同时分 分别为10～、O．5xlO’4、10’4 mol／l(E2和P的终浓度根据MTT 结果选取)，并设含O．01％乙醇培养液为对照。药物与细胞共培 吸去上清，加入200u埒LDMSO终止反应，振荡10min使结 晶物充分溶解，用酶标仪测490nm波长吸光度(A值)。以 只加培养液不加细胞的空白孔调零。根据公式：抑制率=(1一 出现负值，说明是增殖作用，改称增殖率。本实验重复3次。 3细胞周期和细胞凋亡率的检测：将浓度为3x104／ml 细胞悬液接种与100ml培养瓶，过夜贴壁，试验组取各组最 大浓度，即E2组浓度为10由mol／lP组浓度为104mol／l，E2+P 2组和P组。对照组加含0．01％ 组，E2和P的终浓度分别同E 乙醇的培养液。收集实验组药物处理24h后的细胞，冷PBS 洗涤离心两次，用冷75％乙醇固定，4℃过夜，次日冷PBS 洗涤离心一次，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。不同药物及 不同浓度均重复3次取平均值。 4细胞形态学观察： (1)倒置显微镜观察：每日观察细胞的生长状况及药 物作用后的形态学改变。(2)光学显微镜观察：在6孔板中 进行细胞爬片，药物作用24h后将片取出，PBS清洗，冷丙 中文摘要 酮固定，姬姆萨(Giemsa)染色，光学显微镜下观察正常细 胞和凋亡细胞形态。试验组取各组最大浓度，即E2组浓度为 10曲mol／1 别同E2组和P组。对照组加含0．01％乙醇的培养液。(3)电 子显微镜观察：将相同浓度的Ishikawa细胞悬液接种与 100ml培养瓶中，药物(浓度同上)处理后培养24小时，经 O．25％胰蛋白酶消化液消化后收集细胞，4％戊二醛4C固定、 脱水、浸透、包埋、切片、染色，采用难M．1230型透射电 子显微镜观察。 内置盖玻片的6孔板上，加入培养液，置于C02培养箱中孵 育24小时，再加入经无血清培养液稀释的药物，不同浓度 的药物和细胞共同培养24h。试验组取各组最大浓度，即E2 组浓度为106mol／l 终浓度分别同E2组和P组。对照组加含O．01％乙醇的培养 液。药物处理24h后，取出盖玻片，自然晾干，立即以4C 冷丙酮固定10min，以链霉素抗生物素蛋白．过氧化物酶连接 法：每一受体2张玻片，每片至少观察5视野，阳性染色为 细胞内出现棕黄色颗粒，以I代表颜色深浅，共0～3分：0 分为不着色；1分为着色浅；2分为中度着色，呈深黄色；3