转THPO和FL膜外区基因骨髓间充质干细胞对脐血造血干%2f祖细胞体外扩增研究.pdf

浙江大学博士论文 摘要 摘要 造血干细胞(HSCs)是指那些具有自我更新能力并能分化为所有血系细胞的干细胞。 造血干细胞移植(HSCT)常被用来治疗血液系统疾病和作为血液系统恶性疾病高剂量化疗 后的支持治疗。骨髓、外周血和脐带血是人类的主要造血干细胞源。由于脐带血中含有比骨 髓和外周血更高比例的原始造血干细胞，目前认为脐带血是比骨髓和细胞因子动员的外周血 更有前途的造血干细胞源。同时研究发现接受脐带血移植的病人的移植物抗宿主病(GVHD) 的频率明显减小。单份脐带血中的造血千细胞对于重建儿童和体重较轻的成人的造血系统是 足够的，但是，对于体重较大的成年人是不够的。为了解决这个问题，必须对脐带血造血干 细胞进行体外扩增。本研究利用基因工程技术发展了一种独特的转双基因骨髓间充质干细 胞，并利用该转基因骨髓间充质干细胞磺合细胞园子对脐带血造血干细胞进行体外扩增。 骨髓间充质干细胞(MSCs)是来源于中胚层的具有很强的自我更新和多向分化能力的 干细胞。本研究成功地分离纯化了骨髓阃充质干细胞，并研究丁骨髓阃充质干细胞的体外生 长特性。这些骨髓间充质干细胞在表型上呈典型的梭形纤维状，原代培养时间大约为14d。 生长动力学分析-表DJJ，骨髓问充质干细胞呈典型的“s”型生长曲线。传代培养后细胞增殖 能力增强，P2一P20代之间每代持续时间大约为6d：但P20—P30代之间细胞话力下降，每代 持续时间大约为9d。在200d的培养期内，群体倍增时间在30—59h之间。在1—125d的培 养期内，群体倍增时间缓慢维持在30--40h之间；在125--200d的培养期内，群体倍增时间 急速从40h上升到59h。815％的骨髓间充质干细胞处于GdG，期，呈典型的干细胞特性。 流式细胞术分析表明，骨髓间充质干细胞表面抗原CDl66、CD29和CD44为阳性，CD45, CD34和HLA．DR为阴性。 血小板生成素(THPO)和Flt．3配体(FL)是两个重要的早期造血刺激园子。本研究 利用RT-PCR技术成功地从含有高丰度TttPO和FLmRNA的胎肝细胞中克隆了THPO和 FL膜外区基因。序列分析表明，THPO基因除了在蛋自信号肽序列中有一个碱基与Genebank 中序列不同外，其他序列～致；FL膜外区序列与Genebank中序列完全一致。为了将THPO 和FL膜外区基因导入骨髓间充质干细胞，我们利用内部核糖体进入位点序列(IRES)构建 了双顺反子共表达逆转录病毒载体pLXPFIT。利用前刺激+离心沉淀+多轮转染的转染方法 将逆转录病毒载体pLXPFIT导入骨髓间充质干细胞。RT-PCR和westernblotting分析表明， 转基因骨髓间充质干细胞中THPO和FL膜外区mRNA和蛋白表达水平明显高于原代骨髓 问充质干细胞。酶联免疫吸附实验(ELISA)分析证明在8代的转基因骨髓问充质干细胞培 浙江大学博士论文 摘要 养期内THPO和FL膜外区蛋白能稳定有效地分泌表达。另外，转EGFP骨髓问充质干细胞 自2在12代的培养期内稳定表达EGFP荧光。这些结果表明，THPO和FL膜外区基因已经成 功地导入骨髓间充质干细胞，并实现了稳定高教的蛋白表达。 进一步我们研究了转基因骨髓间充质干细胞是否能有效支持脐带血造血干细胞的体外 扩增。第一阶段(2wk)的含血清培养结果表明，转基因骨髓间充质干细胞联合干细胞因子 (SCF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM．CSF)和白介素一3(IL-3)能分别扩增有核 对照组的扩增倍数。尽管2wk的无血清培养对有核细胞总数、CD34+细胞和CFU·Cs的扩增 倍数比含血清培养有所下降，但在两种培养条件下CFU．GEMM的扩增倍数差异不显著。为 了研究转基因骨髓间充质干细胞是否能支持成鹅卵石样造血干细胞(cAFc)的长期活性， 我们进行了第二阶段(6wk)的扩增培养。结果表明，在0--4wk的扩增期内，尽管转基因 骨髓间充质干细胞体系对有核细胞总数、CD34+细胞、CFU—Cs和CFU-GEMM的扩增明显 高于骨髓间充质干细胞体系，但是两个培养体系对所有四个指标的扩增都呈相似的下降趋 势。可是，在4—6wk的扩增期内，原代骨髓间充质干细胞体系不能有效地支持造血干细胞 扩增，而我们建立的转基因骨髓间充质干细胞体系能有效地支持成鹅卵石样造血干细胞的体 外扩增