鸭疫里默氏菌OmpA与鸭IL-2融合基因的克隆与原核表达.pdfVIP

ChineseJournalofVetefina~ Medicine 中国兽医杂志 2014年(第50卷)第8期 43 在鸭病中的应用的报道较少。 18．85 L，总体积25 L。PCR反应条件：94℃预变 本试验为 了提高RA基 因工程疫苗免疫效 性5min；94℃变性 1min，51℃退火 1min，72℃延 果，将RAOmpA基因与从健康鸭外周血淋巴细胞 伸 1min，30个循环；72℃再延伸 10min。 总RNA中扩增 出的DuIL一2基 因，两段基因以一 linker--DulL-2PCR反应体系：pMD—DuIL一20．5 段柔性linker相连 ，利用SOE—PCR技术 ，构建Om． L，DuIL一2一P30．5 L，DuII广2一P40．5 L，2．5mmoY pA—DuIL一2融合基 因，并进行 了原核表达 ，经 LdNTPsMixture2．0 L，10xPyrobestBuffer(Mg2+Plus) Western—blot分析 ，表达 出的融合蛋 白同时具有 2．5L卜L，PyrobestDNA聚合酶(5U／1)0．15 L，ddH20 OmpA和DuIL一2的免疫原性 ，并为进一步开发和 18．85 L，总体积25txL。PCR反应条件：94oC预变 研制新型RA基因工程疫苗奠定了基础。 性5min；94℃变性45S，51℃退火45S，72℃延伸 1 min，30个循环；72℃再延伸 10min。 1 材料与方法 PCR产物 回收按照AxyPrepDNA凝胶 回收试 1．1 菌株、质粒和载体 大肠杆菌Rosetta(DE3)， 剂盒说明书进行。 购 自北京全式金生物技术有 限公司；pET一28a表 1．5 克隆载体pMD—OmpA—DuIL一2融合质粒 的 达载体 由本实验室保存 ；pMD—JL—RA1一OmpA、 构建 ． pMD—DuIL一2重组质粒由本实验室构建并保存。 1．5．1 SOE—PCR扩增OmpA—DuIL一2融合基因 1-2 主要试剂 IPTG、卡那霉素、SDS、30％丙烯 OmpA—DuIL一2融合基因PCR反应体系：linker- 酰胺 (29：1)、Tris、TEMED、NC膜 ，购 自北京鼎 国 DulL-2回收产物0．3IxL，OmpA—linker回收产物0．7 昌盛生物技术有限责任公司；中分子量预染蛋白 L，OmpA—P10．5wL，DuIL一2一P4O．5 L，2．5mmo]／ Marker、DAB显色试剂盒 ，购 自上海生工生物工程 LdNTPsMixture2．0 L，10~ExTaqBuffer(Mg2Plus) 技术服务有限公司；抗鸭IL一2单克隆抗体 、HRP 2．5 L，ExTaq(5U／~1)0-3txL,ddH2O18．2ixL，总体 标记羊抗鸭IgG、HRP标记羊抗 鼠IgG，购 自美国 积25 L。PCR反应条件 ：94oC预变性5min；94℃ KPL公司。 变性 1min，55℃退火 1min，72℃延伸 1min，30个 1_3 试验引物设计 根据吉林分离株JL-RA1OmpA 循环 ；72℃再延伸 10min。 (登录号HQ707077)设计特异性引物P1和P2，上游 1．5．2 pMD18一OmpA-DulL一2重组表达质粒的构 引入BamHI酶切位点，下游引入一段互补的linker。 建 将分离株分别按照AxyPrepDNA凝胶回收试 DulL-2成熟片段基因序列 (登录号AY193713)设计 剂盒说明书和pMD一18TSimpleVector说明书将进 特异性引物P3和P4，上游引人另一段互补