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ALA-PDT 对人增生性疤痕成纤维细胞的杀伤作用 摘 要 目的：成纤维细胞增殖和局部微血管异常增生是增生性疤痕的主 要病理特征，现有非手术治疗手段通常通过抑制成纤维细胞增殖或抑 制血管增生达到治疗目的。光动力学治疗已被证实在抑制肿瘤细胞增 殖、破坏局部血管网方面疗效确实。因此，我们提出了应用光动力学 治疗增生性瘢痕的设想，本研究初步探讨 5-氨基酮戊酸（5- aminolevulinate acid,5-ALA ）介导的光动力治疗（Photodynamic therapy，PDT）对体外培养的人增生性疤痕成纤维细胞的杀伤作用， 为动物体内试验及将来的临床应用提供依据。 方法：1）收集临床增生性疤痕和正常皮肤标本，常规酶消化法 分离获得成纤维细胞，体外培养扩增。取第4-6 代成纤维细胞，在含 有和不含有血清的培养液中添加ALA 培养，孵育4 小时后通过光镜观 察细胞形态，激光共聚焦检测细胞内 ALA 代谢中间产物原卟啉 IX （Protoporphyrin IX, PpIX）的积聚，并做荧光强度定量分析，探 讨ALA 是否能被成纤维细胞吸收并产生PpIX 的积聚，及培养液中血 清对细胞内PpIX 积聚的影响。2）用635nm 波长的激光照射，总能量 选择10J/cm2，功率密度选择100mw/cm2、10mw/cm2,光镜观察治疗前 后细胞形态变化，MTT 法检测处理24 小时后的细胞存活率，探讨PDT 2 对瘢痕成纤维细胞的杀伤作用。3）采用相同的功率密度（100mw/cm ） 不同的总能量（0-10 J/cm2 ）进行照光处理，光镜观察细胞形态变化， TUNEL 染色确认细胞死亡方式，AnnexinV/PI 双染后流式细胞仪分析， 检测细胞发生凋亡和坏死的比率，探讨不同照光条件对细胞杀伤的作 用方式。 结果：1）在无血清培养条件下， ALA 处理后4 小时，成纤维细 胞产生皱缩，而未处理组无明显形态学变化；在有血清条件下，ALA 处理组未处理组均未见明显形态改变。激光共聚焦检测可见ALA 处理 4 小时后无血清培养组细胞内有明显的PpIX 积聚，而有血清组PpIX 的荧光强度较无血清组弱。2)10J/cm2 能量照光后，无血清培养条件， ALA 处理组细胞24H 内漂浮坏死，MTT 检测生存率为 11%-69%，与未 用ALA 处理组存在显著差异。有血清条件下，ALA 处理组与未处理组 2 2 无显著差异。3）在低能量2J/cm -4J/cm 激光照射下，部分细胞TUNEL 染色呈阳性，而在高能量照射时，细胞 TUNEL 染色呈阴性。 AnnexinV/PI 双染后流式细胞仪分析显示低能量激光照射时，约有 3.6%-15.6%的细胞发生凋亡，而能量加大到10J/cm2 时大部分细胞发 生坏死。 结论：1）人增生性疤痕成纤维细胞经外源性ALA 处理后，可产 生PpIX 的积聚，血清降低PpIX 的积聚。2）ALA-PDT 对成纤维细胞 有杀伤作用。3）低能量PDT 诱导细胞凋亡，高能量PDT 诱导细胞坏 死。 关键词：疤痕，成纤维细胞，血清，ALA-PDT，凋亡 THE INHIBITORY EFFECTS OF ALA-PDT ON FIBROBLASTS FROM HUMAN HYPERTROPHIC SCAR ABSTRACT Objective： Hypertrophic scar is characterized by fibroblasts proliferation and microvascular dysplasia. Existing non-surgical treatment is treated by inhibiting fibroblast proliferation or inhibiting angiogenesis.Photodynamic therapy is effected in Inhibiting tumor cell proliferation and destructing abn