甾醇C-22去饱和酶高表达对酵母细胞麦角甾醇合成的影响.pdfVIP

47卷2期 微 生 物 学 报 47(2)：274—279 2007年4月4日 sin耙4 4ADdl2007 Ac把Mkmb泌蛔和d 甾醇C．22去饱和酶高表达对酵母细胞麦角甾醇合成的影响 蔡鹏丽1’2，何秀萍”，刘 楠1，张博润1 (1中国科学院微生物研究所北京100080) (2中国科学院研究生院北京l㈣9) 摘要：通过PcR扩增克隆到酵母菌甾醇c一22去饱和酶基因(肼岱)的编码序列及其终止子序列，以大肠杆菌，酿 酒酵母穿梭质粒1rEp352为载体，以磷酸甘油酸激酶基因尸GK』启动子为上游调控元件构建了酵母菌表达质粒 pYPE5。以铜离子螫合蛋白基因c已P，替换职西基因内部序列获得艘岱破坏菌株YSE5，其中麦角甾醇的合成被 能力。说明表达质粒上的E矾5基因得到了功能性的表达。将表达质粒pYPE5转化酿酒酵母单倍体菌株YS58，通 过营养缺陷互补筛选到重组菌株Ys58(pYPE5)。对重组菌株、破坏菌株和互补菌株细胞甾醇组分和含量进行测定， 发现重组菌株和互补菌株的麦角甾醇和总甾醇含量明显低于对照菌Ys58(YEp352)。测定不同培养时间细胞的麦 角甾醇含量，发现重组菌株的麦角甾醇含量始终低于对照菌YS58(YEp352)。可见．E雕5在酵母中的高表达导致细 胞麦角甾醇含量降低。 关键词：酿酒酵母；甾醇c一22去饱和酶基因(E肌5)；高表达；麦角甾醇 中图分类号：Q933文献标识码：A 文章编号：000l一6209(2007)02—0274．06 麦角甾醇是真菌细胞各种膜结构的重要组成部 分，在细胞内起着多方面的生理功能。并且它是合 戊酸焦磷酸脱羧酶的高表达则导致甾醇合成的降 成维生素D：的前体，而维生素D2在调节生命代谢 低…，还有些酶活性的提高对甾醇的合成几乎没有 影响”o。因此检测甾醇生物合成途径中不同位点酶 功能上有重要的作用。此外麦角甾醇还是一种重要 活性的提高对麦角甾醇合成的影响，从而确定麦角 的医药化工原料，用于甾醇类药物的生产。酵母菌 甾醇合成途径中的限速步骤，既可以为全面阐述甾 是生产麦角甾醇的主要菌种，而酵母中麦角甾醇的 醇化合物生物合成的调控机制提供理论依据；同时 生物合成是一个多酶催化的非常复杂的过程，已有 对通过基因工程技术提高细胞麦角甾醇的生物合 的研究表明在酵母菌中至少有21个基因产物参与 成，是很有意义的，并且是必要的。朋∞基因编码 了麦角甾醇的生物合成，而且其生物合成的调控是 的甾醇c-22去饱和酶催化酵母麦角甾醇生物合成 多层次的…，其中相关基因在转录水平的调控是主 途径中的第20步反应，在甾醇侧链的c一22位引入 要的，而且这种调控还与甾醇的反馈作用有关，在部 反式双键，形成四烯甾醇。该基因已被克隆和测 分基因的调控序列中含有甾醇水平应答元件”“1。 序”1，但有关甾醇c．22去饱和酶催化的此步反应在 因此通过基因工程手段解除转录调控可能是改变甾 麦角甾醇生物合成中的调控作用还不清楚。本文报 醇合成和细胞内甾醇组分的有效途径”J。 道了甾醇c一2