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质粒DNA的提取及鉴定 生物化学与分子生物学系 伍兵 实验目的 掌握质粒DNA制备的原理和方法 了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离 Bacterial DNA Plasmids 质粒 　碱裂解法流程图 对数期菌体 溶液III中和 溶液I充分重悬 溶液II裂解 上清液（含DNA) 酚/氯仿去蛋白 70%乙醇洗涤沉淀 乙醇沉淀DNA TE溶解DNA 电泳鉴定 溶液Ⅰ： 50 mmol/L 葡萄糖 10mmol/L EDTA 25mmol/L Tris-HCl pH8.0 溶液II（新鲜配制）: 1mol/L NaOH 200?l 10% SDS 100 ? l H2O 700 ? l 溶液 III : 29.4g Kac 11.5ml冰醋酸 加水至100ml 实验流程 细菌于LB培养基中培养过夜，分装（1ml/支），4000rpm离心2min，弃上清。 沉淀重悬于100?l溶液Ⅰ中, 震荡混匀。 加入200 ? l新鲜配制的溶液Ⅱ，轻轻颠倒混匀(不能超过5min）。 立即加入150 ? l溶液Ⅲ，轻轻颠倒混匀，冰浴5min，12000rpm离心10min。 上清移至另一干净EP管中，加入等体积饱和酚，颠倒混匀，12000rpm 离心10min。 上清移至另一干净EP管中，加入等体积酚/氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心10min。 上清移至另一干净EP管中，加入2倍体积冷无水乙醇混匀，静置5min，12000rpm离心10min。 弃上清，用0.5ml 70% 乙醇洗涤DNA，12000rpm离心5min弃上清，倒置干燥。 加入10?l TE，1%琼脂糖凝胶电泳观察。 核酸的定量 260 nm， 1OD值相当于： 双链DNA浓度为50?g/ml 单链DNA浓度为40?g/ml A260/A280 = 1.8（DNA） A260/A280 = 2.0（RNA）