动物肝脏中DNA的提取和定量测定.ppt

1. 称取猪肝8g,用匀浆器(或研钵)磨碎(冰浴),加入相当两倍肝重的0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液,研磨三次,然后倒出匀浆物,4000r/min离心10min,沉淀中加入25 ml缓冲液,于4000r/min离心20min,取沉淀。(电子天平称量和离心机的正确使用和注意事项的测试) 2. 加入40ml0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、20ml氯仿-异戊醇混合液、4ml5%SDS溶液,振遥30min,然后缓慢加固体NaCl(约3.6g), 3500r/min离心20min,取上清夜。（量筒和烧杯的正确使用和注意事项的测试） 3. 加入等体积冷95%乙醇,边加边搅动,用滤纸吸去多于的乙醇,缠绕在玻棒上的即为DNA粗品。（加液、搅拌、吸水等实验操作技术的测试） 4. 用蒸馏水溶解,并定容至50ml（容量瓶的正确使用和注意事项的测试），待测。 学习和掌握二苯胺法测定DNA的原理和方法。 1.标准曲线的绘制：P145，参考OD值：0.07、0.12、0.17、0.22、0.26。 （移液管的正确使用和注意事项及绘图技术的测试） 2.样品的测定:测定DNA样品。(做3管取平均值，另还要做对照管即标准曲线中的0号管)。（分光光度计的正确使用和注意事项的测试） 3.计算100g猪肝中DNA含量。（数据处理统计分析的测试） * 实验七、动物肝脏中DNA的提取 一、实验目的： 学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理及技术。 二、实验原理： 核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在； DNA核蛋白易溶于高浓度盐(1mol/LnaCl)溶液； SDS(十二烷基硫酸钠)引起蛋白质变性也可使核酸降解酶 破坏(保护DNA不被降解)； 氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去； 乙醇沉淀DNA。 实验七、动物肝脏中DNA的提取 三、实验器材： 1. 新鲜猪肝（每人实用8g） 2. 匀浆器（或研钵） 3. 量筒（50ml、10ml） 4. 烧杯100ml 5. 三角瓶（150ml） 6. 离心机（最多两人合用一台） 7. 离心管（每人6支） 8. 试管及试管架 9. 吸管 10. 50ml容量瓶 11. 电子天平 实验七、动物肝脏中DNA的提取 四、实验试剂： 1．0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液(pH6.8)。 2．0.015mol/LNaCl-0.01mol/L柠檬酸三钠溶液。 3．95%乙醇 4．NaCl固体 5．5%SDS（十二烷基硫酸钠）溶液 6．氯仿 7．V（氯仿）：V（异戊醇）混合液20：1 实验七、动物肝脏中DNA的提取 五、实验步骤： 1. 称量、研磨、离心、取沉淀； 2. 沉淀+加缓冲液+氯仿-异戊醇混合液+SDS 振摇 加固体NaCl 离心 取上清液； 3. 在上请液中加入乙醇,边加边搅拌使DNA缠绕在玻棒上，得DNA粗品； 4. 定容待测。（具体方法见下页） 实验七、动物肝脏中DNA的提取 五、实验步骤（具体）： 实验七、动物肝脏中DNA的提取 六、注意事项： 是提取实验，要想法提高得率： 1. 要充分研磨； 2. 要在冰浴条件下进行； 3. 要加保护剂； 4.转移要彻底。 实验八、DNA的定量测定（二苯胺法） 一、实验目的： 二、实验原理： DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中与二苯胺试剂作用生成蓝色化合 物,在DNA浓度为20~200ug/ml范围内, 吸光度与浓度成正比, 在波长为 595nm下进行比色测定。 实验八、DNA的定量测定（二苯胺法） 三、实验器材： 四、实验试剂： 移液管 恒温水浴锅 可见分光光度计 坐标纸 DNA标准溶液（200ug/ml） 二苯胺试剂 DNA样液 实验八、DNA的定量测定（二苯胺法） 五、实验步骤： 1. 是定量实验，称量、加液要准确； 2. 时间要控制好。 六、注意事项： 七、实验报告：按常规。