培养细胞组织的检测方法.ppt

真核细胞胞质中有错综复杂的纤维网,称为细胞骨架。根据纤维的直径分为微丝,微管等。 应力纤维在体外培养的贴壁细胞中发达，其是由微丝平行排列组成的纤维束，一般当细胞充分铺展时,经考马斯亮蓝R250染色,可看到沿细胞长轴伸展的纤维束。 ②四唑盐（MTT）比色法 2）细胞生长情况 ① 细菌的污染及检测 细菌污染后，培养液短期内颜色变黄，产生大量酸性物质，出现明显混浊现象，培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。通常在严格的实验操作之外，培养基中加入青霉素、链霉素能够有效的防止细菌污染。 ② 真菌的污染检测 真菌的污染物通常是在显微镜下可见丝状细胞的交叉。真菌污染后，细胞生长变慢，最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。 酒精棉球擦洗清除瓶口污染。 * * 培养细胞组织的检测 test and observation of cell culture 授课教师：陈筠 一、细胞固定染色和观察 固定:防止组织细胞自溶与腐败，使细胞内的各种 成分如蛋白质、脂肪酶类等转变为不溶性物 质，以保持原有的结构和生活时相仿。将细 胞制成永久标本进行观察。既可显示细胞形 态，也可揭示细胞的微细结构。 新鲜活组织从生物体取出→立即投入固定液→ 保持细胞原有形态、结构。 固定液： 单一固定液：一种药品作为固定液，如乙醇、甲醛、 冰醋酸等,只对细胞的某种成分固定效果较好。 混合固定液：几种不同的药液按一定的比例混合而 成，使各自的优缺点相互补充 。 常用几种固定液： （1）酒精：有固定、硬化、脱水的作用。 注意：酒精能溶解脂肪，故不宜用来固定脂类材料。 （2）甲醛水溶液：10%福尔马林液，渗透力强，固定 均匀，对组织收缩作用小。 尤其对脂肪、神经组织固定效果较好。更适用于病理组织的制片及大体积标本的保存，一般组织需固定24小时以上。 （3）冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时（16.6℃以下） 能结成冰状的固体，所以称为冰醋酸。 醋酸对染色体的保存能接近生活状态，故常用于 染色体的固定。 （4）卡诺氏固定液：冰醋酸：氯仿：无水乙醇=1:3:6 能迅速穿透细胞，固定并维持染色体结构的完整性。 常用染料： 1、染细胞核（碱性染料） 苏木精：常用于永久切片的制作。 2、染细胞质（酸性染料）：伊红 二、染色与染色原理 吉姆萨染色（Giemsa）： Giemsa染液：天青（碱性染料），伊红（酸性染料）组成。 形态学检验、寄生虫检验 嗜碱性粒细胞 中性粒细胞 嗜酸性粒细胞 苏木精-伊红染色（H-E染色）： 适用：各种固定、包埋方法所制作的组织切片和冰冻切片等 鉴别细胞凋亡: 细胞凋亡(apoptosis)：细胞主动的死亡过程，其发生是 受程序控制，逐步激活凋亡通路引起的，不产生炎症。 1、细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离 2、细胞质密度增加，核质浓缩，核膜核仁破碎，胞膜有小泡状 形成，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体。 3、不引起周围的炎症反应。 凋亡小体多呈圆形或卵圆形，大小不等，胞浆浓缩，强嗜 酸性，有/无固缩深染的核碎片，故有时称之为嗜酸性小体。 细胞凋亡 Hoechst33258染色 Hoechst33258为特异性DNA染料。 结果：在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散、均匀荧光，坏死细胞不被Hoechst染色。 出现细胞凋亡时，核或胞质内可见浓染致密的颗粒块状蓝色荧光及明显核形态变化，如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞。 甲基绿-派诺宁染色法 原理： 细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态， 但两者发生机制不同。 细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，细胞质内常有mRNA表 达的增强。而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内 常有RNA的损失。 甲基绿对DNA染色有特异性，派诺宁对RNA有亲和性，故甲 基绿对固缩细胞核着染，如果细胞质呈派诺宁阳性染色者为凋 亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞。 结果：光学显微镜下凋亡细胞固缩，细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色着染，坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染。 细胞骨架观察 考马斯亮蓝R250染色法观察微丝 实验原理 在myosin肌球蛋白的作用下微丝纤维滑动，使细胞主体前移 培养细胞观察与检测方法 细胞培养后，需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行连续的观察。 一、常规检查和观察方法 二、活细胞观察 观察：污