小鼠肝组织RNA提取及RTPCR实验(年制).ppt

小鼠肝组织RNA提取及RT-PCR 试剂及材料 1、小鼠肝脏 2、DEPC处理过的EP管、PCR管 3、 Trizol 、氯仿、异丙醇、DEPC水 实验原理 实验步骤 RNA提取 1、新鲜肝组织置EP管中，加200?l Trizol充分研磨后，补加800?l Trizol，吹打混匀。 2、加入200?l 氯仿，剧烈震荡15秒，4℃ 12000g离心15min。 3、将上层水相移至洁净EP管中，加入500?l异丙醇颠倒混匀。 4、4℃ 12000g离心10min。 5、弃水相，EP管开盖干燥后，加50?l DEPC水溶解。 RT-PCR：RNA的反转录 + cDNA的PCR RT-PCR操作步骤 5x Prime Script Buffer 2 ?l ① Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 ?l ② Oligo dT primer (50 ?m) 0.5 ?l ③ Random 6 mers (`100 ?m) 1 ?l ④ 提取的RNA 0.5 ?l RNase Free 水 5.5 ?l ⑤ 37℃ 15min 85℃ 5 sec 10x PCR Buffer 5 ?l dNTP 4 ?l 模板DNA 2 ?l 引物1 2 ?l 引物2 2 ?l Tag 酶 0.5 ?l H2O 34.5 ?l 94℃ 5 min 94℃° 30 sec 54℃° 30 sec 72℃ 30 sec 72℃ 7 min * Trizol：异硫氰酸胍 + 苯酚 (pH5.0) 裂解细胞，RNA与蛋白质分离，将RNA释放到溶液中。 促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机相层。 RNA存在于水相层（无色）， DNA和蛋白质存在于有机相层（黄色）。 +氯仿 10 ?l 1、反转录 反转录反应时Primer的选择 反转录引物的选择，应结合实验的具体情况，选择以下三种引物，即：Random 6 mers、Oligo dT Primer或特异性下游引物。对没有发夹结构的短链mRNA，上述三种引物都可以使用。一般情况下的反转录引物的选择请参照以下说明。 必须与模板序列互补，需了解Target序列。 特异性下游引物 ?(PCR时的下游引物) 适用于具有Poly(A) 尾的RNA。(注意：原核生物的RNA、真核生物的rRNA、?tRNA以及某些种类的真核生物的mRNA等不具有Poly(A))。 Oligo dT Primer 适用于长的或具有Hairpin结构的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录都可使用该引物。 Random 6 mers 50 ?l 2、PCR 25 cycle 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果 *