实验二蛋白质定量分析(五年制).ppt

实验二、 蛋白质定量分析 蛋白质定量分析即蛋白质溶液的浓度测定； 现实应用：1. 临床检测——血清蛋白浓度测定；2. 科学研究——纯化蛋白的浓度测定； 主要方法 根据蛋白质元素组成——凯氏定氮法； 根据蛋白质组成特点建立的比色法——双缩脲法，lowry改良法，考马斯亮蓝染色法，BCA法； 根据蛋白质的吸收特性建立的紫外分光光度法； 双缩脲法 测定蛋白质范围：1-10mg/ml 选用波长：540nm 仪器：VIS-7220、UV5200 缺点：灵敏度较差，特异性不高 实验步骤 标准曲线法测定蛋白质浓度 （一）标准曲线作用 判断所采用的呈色方法是否符合Lamber-Beer定律 判断测定过程中操作、仪器等误差的大小，确定该方法的可靠性 从斜率可以比较各种方法的灵敏度 进行大批样品分析时，可省略多次计算，从OD值直接查阅标准曲线求得被测物质浓度 蛋白质的紫外吸收 核酸的最大吸收峰在260nm，可能发生干扰，须同时测定OD260与OD280，根据两种波长OD的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。 测定蛋白质范围：0.1-1mg/ml 选用波长：260nm 280nm 仪器：UV-9200、UV5200、UV-2000 优点：操作简便，纯化蛋白质的微量测定 缺点：核酸干扰，精确度差 实验步骤 操作：不做标准曲线，只测空白管和测定管 计算：利用经验公式直接计算 OD280/OD260＜1.5时 样本浓度(mg/ml)=1.45OD280-0.75OD260 OD280/OD260＞1.5时 样本浓度(mg/ml)=(OD280/6.3×1) ×10g/L * /wiki/456254.shtml 一、实验原理——双缩脲反应 OH- 蓝色 紫红色 在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比——1-10mg； 蛋白质的双缩脲反应 Cu2+ OH- 1 2 3 4 5 6 7 标 准 管 测定管 空白管 试剂 蛋白质标准液10mg/ml 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蛋白质测定液（ml） 1.0 0.9%NaCl （ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0 双缩脲试剂 （ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 37℃水浴20min，540nm比色，空白管调零 由于单色光透过溶液时，不仅被待测物质所吸收，而且还被比色容器与溶剂以及其它试剂吸收一部分，这部分需用空白管消除； 空白液的做法即用与样本相同的一切试剂，而不含被测定的物质。 空白管 标准曲线制作 根据Lambert-Beer定律， A与C成正比 配制一系列标准液 C1、C2、C3??， 在?max下，测相应的A1、A2、A3……。 AX CX 仪器: lmax: 日期: 室温: 图1：XXXXX Tyr Trp 蛋白质分子中含有共轭双键的芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质。 其最高吸收峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比。 由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，因而要有待测的蛋白质的标准品作比较，才能进行准确定量。 样品(ml) 测定管 空白管 待测血清样本 0.4 生理盐水 3.6 4.0 紫外法测定蛋白质浓度须采用标有H字样的石英杯 *