稠环芳烃高效液相色谱法分析419-2.pptVIP

实验讲解要点 一、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压-压力可达150~300Kg/cm2。 高速-流速为0.1~10.0 ml/min。 高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快-通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。 柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 二、高效液相色谱法按分离机制: 二、高效液相色谱法按分离机制的不同分为： 液固吸附色谱法、 液液分配色谱法（正相与反相）、 离子交换色谱法、 离子对色谱法、 分子排阻色谱法。 液液色谱法　 现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 四、反相色谱法及分离原理 正相色谱法　 采用固定相为极性的，流动相为相对非极性的疏水性溶剂 反相色谱法及分离原理 一般用非极性的十八烷基键合相（ODS）为固定相，极性的水或缓冲液中加入甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂（有机溶剂以调节保留时间）为流动相，在反相色谱法分离中极性大的化合物先留出，碳原子数少的样品先留出。 适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱法在现代液相色谱中占整个HPLC应用的80%左右。 高效液相色谱与气相色谱峰异同点 HPLC 流动相：液体 液体粘度大，扩散系数小 流动相可广泛选择，并可配成多元体系 因此分辨率高 高效液相色谱采用5～10um细颗粒 固定相，流动相通透性小，必须用 高压输送。 应用更广，有机物75～85%可采用 高效液相色谱法进行分离。 适应于高沸点难挥发，热稳定性差的物质 高灵敏度，可检测ng/ml样品 。 GC 流动相：载气 气体粘度小，扩散系数大，流动相选择余地小 不用高压泵输送 只有25%只有有机物能用GC进行分离 适应于易挥发、较低沸点，热稳定性好的物质 灵敏度高，可检测ng/ml样品 高效液相色谱仪的基本组成 高效液相色谱流程示意图 高效液相色谱的定性与定量 定性的方法：采用保留值定性，在实验条件相同（如温度、流动相比例等）的条件下，将未知物的保留时间与已知纯物质的保留时间对比而进行定性分析 定量的方法：采用峰面积的归一化法，内标法或外标法定量。 外标法进行定量时不需要考虑校正因子，可根据试样的峰面积(Ai)和已知含量的标样中组分的峰面积(As)，求得样品的含量。 XsAi Xi(%)= ×100 As 六、实验部分 实验内容与主要步骤 数据及处理 1、记录实验条件： 色谱柱与固定相，流动相与流量，进样量 2、测量各色谱峰中苯、萘、联苯等的保留时间tR及相应色谱峰宽W,计算各对应的理论塔板数n、分离度R等（也可用软件直接操作） 3、将不同含量混标液为横坐标，对应的峰面积为纵坐标作图求标准曲线方程，测定未知样品的峰面积代入标准曲线方程，求样品的浓度。 使用高效液相色谱仪的注意事项 　　1 HPLC的日常操作条件 　　工作温度10～30℃； 相对湿度80％； 最好是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备。 　　2 泵的保养 　　使用流动相尽量要清洁；进液处的沙芯过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀；避免泵内堵塞或有气泡。 　　3 进样器的保养 　　每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。 　　4 柱的保养 　　柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；当柱子和色谱仪连接时， 阀件或管路一定要清洗干净；要注意流动相的脱气；避免使用高粘度的溶剂作为流动相；进样样品要提