高密度光纤芯片技术及其在功能基因组学中的应用.pdfVIP

中国试剂网 高密度光纤芯片技术及其在功能基因组学中的应用 DNA 微阵列技术的发展[1]带来了基因表达研究方法上的一场革命。传统的 Northern blots 或RT-PCR 方法只能逐一地研究单个基因的表达，而DNA 微阵列 技术可以同时例行检测成千上万个基因表达水平的变化，在微芯片上置入寡核苷 酸探针或相应于mRNA 序列的cDNA，与细胞cDNA 或cRNA 进行杂交，可以 纵观细胞的整体基因表达而不是从前的一个局部。例如，毒理学家可以利用基因 表达微阵列芯片快速地对潜在的有毒化合物进行全面评估，仅单个毒理基因组实 验产生的大量数据就可以让研究人员从新的高度评估毒物的毒理机制。基于微阵 列芯片的肿瘤分类、治疗和预后研究正在发展之中，非常有希望与传统组织学和 临床诊断相结合来区分肿瘤类型。这类研究对预测治疗反应也至关重要，可以为 患者提供更准确的诊断方法和更好的治疗方案[2]。 和所有的现存技术一样， DNA 微阵列技术也有其自身的局限性。技术上的挑战 至少有两点。首先，当前的DNA 微阵列芯片不适于mRNA 剪切变化的探测，人 类基因组计划的一个重要发现是人体中表达的蛋白质总数远远超过基因的总数。 选择性基因剪切，一种转录后的剪切和拼接机制，使得有限基因上生成的蛋白质 具有较大变化。人类基因研究已经揭示近 60 ％的基因具有选择性剪切引起的多 种mRNA 异构体[3]。在已知的几个特例中，单个基因甚至可以产生成百上千种 异构体。果蝇 Dscam 基因估计能够产生约 38000 种 mRNA 异构体，该数目大 约是整个果蝇基因组中基因总数的两倍。此外，研究中经常发现异构体可以产生 功能上相互拮抗的蛋白质，因此非常有必要对不同的mRNA 和蛋白质异构体进 行研究。虽然当前的DNA 微阵列芯片可以用于整个基因组的检测，但是其检测 能力很难胜任分辨mRNA 异构体的要求。cDNA 阵列芯片根本无法测定mRNA 剪接变化。与 cDNA 阵列芯片相比，基于寡核苷酸探针的阵列芯片在分辨能力 上有所提高；但是探针与相似序列间的交叉杂交可能降低探测的灵敏度、确切性 和定量化。此外，传统微阵列芯片的样品制备和扩增偏向3’UTR，可能错过某些 异构体，也可能使探测到的mRNA 异构体的比率失真。对DNA 微阵列技术的另 一个挑战是如何将如此大规模的基因表达研究推向临床应用，这就需要开发一种 在临床环境中能够大规模并行筛选病人样本的技术平台，采用常规微阵列技术很 难实现这一目的。 中国试剂网 光纤芯片技术使上述研究成为可能，该技术采用随机分布的自装配小珠阵列，为 复杂生物样本的并行分析提供了一个新颖的通用技术平台 [4,5] 。大批直径为 3um 的小珠被随机装配到模板化的成像光纤束上，单根光纤束含有约50000 根光 纤，因此可以装配约 50000 个小珠（图 1），阵列中每个位置上小珠的类型通过 解码进行辨识，每个小珠上附着的寡核苷酸探针与样品中带有荧光标记的互补序 列进行特定杂交以产生探测信号（图2 ）。 为了同时自动检测多个样本，小型化光纤束被进一步装配成 96 或384 根的多重 阵列形式，与滴度孔板相匹配（图 3 ），由于每根光纤束可以探测成百上千个目 标，一个96 或384 根光纤束组成的多重阵列可以快速有效地检测大量试样，这 种阵列形式非常适用于临床条件下对患者样本进行直接化验。 首次使用光纤芯片进行选择性基因剪切研究的结果发表在 Nature Biotechnology 上[6] 。此项研究结合了光纤芯片技术与一种独特的 RNA 检测技术(RASL ， RNA-mediated annealing, selection and ligation) 。实验中，RNA 样本与许多对DNA 探针混合，每一对DNA 探针都可能横跨一个假定的RNA 剪接点如果RNA 样本 中含有特定剪接的mRNA ，相应的DNA 探针对就会与该mRNA 进行杂交并通 过连接酶将两个DNA 探针相连，连结后的DNA 产物经扩增和荧光标记后，与 芯片小珠上的互补DNA 进行杂交并产生探测信号。这种方法