不同发育天数及囊胚类型对猪孤雌激活胚胎冷冻效果的研究.pdf

2013年第49卷第1S期 and Reproduction 不同发育天数及囊胚类型对猪孤雌激活 胚胎冷冻效果的研究 许惠艳，胡林林，杨小淦，卢克焕’ (亚热带生物资源保护与利用国家重点实验室，广西大学动物科技学院，广西南宁530004) 摘 要：实验比较不同发育天数所得的早期囊胚和扩张囊胚的冷冻效果。以期找出冷冻前胚胎最佳发育时期 及囊胚类型。以猪孤雌激活胚胎为材料，分别取培养到第5、6、7天所得的早期囊胚(EB)和扩张囊胚(B)进行玻 璃化冷冻保存，解冻后对其复苏率和内细胞团数损伤进行观察和统计。结果表明：发育第5天所获早期囊胚和 团损伤比例上，虽各组差异不显著(PO．05)，但第5天和第6天组损伤低于第7天组。结果提示，在孤雌激活后第 5天选取扩张囊胚进行冷冻。解冻后所得冷冻效果好。 关键词：孤雌激活；冷冻阶段；猪 中圈分类号：$828．3 文献标识码：B 胚胎冷冻保存是哺乳动物胚胎生物工程的关键 1材料与方法 技术环节之一，该技术为珍稀动物、濒危动物及转基 因动物遗传资源的长期保存提供了有效手段，解除 1．1试剂卵母细胞体外成熟液为改良的TCM一 了体外受精、核移植和转基因等胚胎生物技术开展 199培养基，猪胚胎体外培养液为PZM一3，洗卵液为 国际、国内长距离运输的空间和时间等限制【”。影响 哺乳动物胚胎冷冻效果的因素很多，如动物种类、冷 司，其余药品均购自Sigma生物化学公司。 冻剂浓度121、冷冻时降温和解冻速率13】、冷冻时胚胎1．2卵母细胞的采集和体外成熟培养猪卵巢采 所处时期等。其中，胚胎发育时期被认为是影响胚 自当地屠宰场，置于30—35℃加有双抗的生理盐水保 胎特别是体外胚胎冷冻效果的关键因素之一【4】。猪 温瓶中，于4h内运回实验室。运回实验室后，先用剪 孤雌激活胚胎因其自身特点，被越来越多的胚胎工 刀剪掉卵巢表面的结缔组织、脂肪等，再用含有双抗 程领域研究和应用，如体细胞克隆胚胎需大量孤雌 (青霉素、链霉素)的生理盐水洗2～3遍，最后用一次 胚共同移入受体来提高妊娠率IS】、作为干细胞研究 性注射器(12号针头，10mE)抽取卵巢表面直径为 2-6 的材料来源【61、作为嵌合体的受体【71、验证新的培养 mm的卵泡，在体视显微镜下用玻璃吸管挑选带 体系和新技术等研究【引。因此，有必要建立猪孤雌激 有2层卵丘细胞且胞质均匀的卵子，用洗卵液洗涤3 活胚胎冷冻库，满足科研和生产的需要。但目前对 遍无杂质后，放入预平衡好的成熟液中预洗2遍。最 后每25—30个卵母细胞放入100 猪孤雌激活胚胎冷冻的相关研究还较少，对冷冻前 IzL的微滴中，盖矿物油 囊胚最佳获取时期和类型还未有统一的标准。因 培养。培养条件：5％CO，、最大饱和湿度，温度为39℃。 此，本研究以猪孤雌激活后不同发育天数所获早期 1．3卵母细胞的准备、电激活及培养卵母细胞经 囊胚和扩张囊胚进行玻璃化冷冻，比较解冻后冷冻 44—48 h体外培养后，放人含0．1％透明质酸酶的洗卵 效果，旨在找出冷冻前囊胚获取的最佳时期和类型， 液中，用200 IzL的移液枪反复吹打，去除卵丘细胞，然 提高冷冻效率。 后在体视显微镜下观察，挑选胞质均匀