富集宏基因组DNA中淀粉酶全长基因的克隆及重组表达.pdfVIP

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2015-09-20 发布于安徽
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富集宏基因组DNA中淀粉酶全长基因的克隆及重组表达.pdf

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中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology, 2010, 30(3): 56260 DNA A * 1, 2 1, 2 1, 2 1, 2 1 1 1, 2** 杨键曾丽娟廖思明王青艳杜丽琴韦宇拓黄日波 ( 1广西大学生命与科学技术学院广西亚热带生物资源保护利用重点实验南宁 530005) (2广西科学院国家非粮生物质能源工程技术研究中心南宁 530007) 2PCR(IN2PCR) DNA A2 , U045523,B acillu s sp. KR28104 99% 。 A2 pSE380, E sch erich ia coli JM109, IPT 。N i2NTA、SephacrylS2200: XAA pH 7. 0, 75e ,Km 11. 6g/L。 E27 、A450T、E27 2A450T,。 2PCR A2 Q78 传统方法获得功能基因往往要经过菌种筛选、菌公司;E scherich ia coli JM109为本实验保存种鉴定、基因文库构建与筛选等程序, 不仅过程繁琐耗 1. 1. 2 酶和试剂 LA Taq DNA聚合酶购自TaKaRa 时耗力, 而且很容易丢失有价值的基因资源。宏基因公司; 限制性内切酶、KDNA/H in dÓmarker、T4连接酶 [ 1] 及 proteinmolecularmassmarker均购自MBI公司;其余组技术显著改善了基因资源丢失的问题 , 但要从上万克隆的文库中筛选功能基因工作量依然相当巨大, 为国产分析纯。本实验曾成功以富集宏基因组 DNA 为模板一步 1. 1. 3 土样采自广西大学农场堆肥。 [2] 1. 1. 4 培养芽孢杆菌富集培养基(每升含葡萄糖 PCR法直接克隆功能基因。然而对于已知部分序列 8g, 蔗糖 8g, 淀粉 16g, 蛋白胨 15g, 酵母膏 3g, K HPO 的基因, 从环境中获得其全序列要面临更多的问题。 2 4 2g,MgSO 0. 6g)。 A淀粉酶是一种重要的工业酶, 被广泛应用于食品、 4 [324] LB培养基(每升含蛋白胨 10g,酵母粉 5g, NaCl 10g, 纺织、洗涤剂及生物能源等行业。Sajedi等发现了一种耐酸性能优越且不依赖于钙离子的A淀粉酶KRA, 并调 pH至 7. 0)培养基氨苄青霉素终浓度为 100Lg/ml。克隆到编码该酶基因的部分序列(AY841124)。利用反 1. 2 向PCR与巢式 PCR结合的方法从环境宏基因组DNA中 1. 2. 1 芽孢杆菌的富集称取 5g土样重悬于富集培克隆与其有较高同源性的淀粉酶全长基因。养基 ( 100ml)中, 沸水浴 15m in, 37e 、220r/min摇床培养 24h。 1 1. 2. 2 宏因组 DNA的粗提与纯化参见文献[2]。